于金玲
(北京军区天津疗养院,天津300384)
丹酚酸是从丹参中提取的一类既有咖啡酰缩酚酸结构又有新木脂素骨架的水溶性成分。丹参总酚酸是由丹参中提取的各种丹酚酸的混合物,其中以丹酚酸B 含量最高,活性最强,约占70%。丹酚酸B 作为丹参主要有效成分已经证实具有多方面的药理活性。现就丹酚酸B 主要的药理作用综述如下。
1.1 对心肌缺血/再灌注损伤的保护作用心肌缺血再灌注时,大量自由基产生,细胞膜脂质过氧化反应增强,膜流动性和通透性发生变化,导致电生理活动异常,诱发和促进心律失常的产生,心肌细胞脂质过氧化反应增强,致使心肌缺血区的过氧化产物丙二醛(MDA)含量增多、冠脉流出液中乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸磷酸激酶(CPK)升高、心肌组织中超氧化物歧化酶化酶(SOD)减少[1,2]。赵桂峰等[3]研究显示,丹酚酸B 能够提高心肌缺血/再灌注损伤大鼠心肌组织中的SOD 活力,对抗氧自由基的毒害作用,从而减轻心肌细胞损伤。
1.2 对脑缺血再灌注损伤的保护作用 当血脑屏障损伤时,血管内的各种成分,包括免疫球蛋白(IgG)会渗出至脑组织中,脑血管周围IgG 的渗出多少可以反映血脑屏障的损伤程度。基质金属蛋白酶- 9(MMP-9)通过降解血脑屏障基底膜以及内皮细胞之间的紧密连接,参与组织重塑以及血脑屏障的破坏,在血脑屏障损伤时可以观察到MMP - 9 表达上调。MAPK 通路为参与血脑屏障保护作用的一条关键通路,它通过下调或上调MMP -9 对血脑屏障产生保护或损伤作用。
为观察丹酚酸B 对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障的影响,探讨其可能的作用机制,李琴[4]采用大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)法建立脑缺血再灌注模型,检测给药前后与血脑屏障功能密切相关的MMP-9 和一氧化氮合酶2(NOS2)的变化,结果显示,丹酚酸B 明显降低脑血管周围IgG 的渗出,表明其有明显的血脑屏障保护作用,提示丹酚酸B 对脑缺血再灌注损伤的保护作用可能与保护血脑屏障有关。
血管内皮生长因子(VEGF)是内皮细胞特异性的有丝分裂原,具有促进内皮细胞增殖,提高血管通透性等生物学特性。Lay 等[5]的实验研究发现,丹酚酸B在体外能够调整VEGF 和VEGF 受体水平,促进血管内皮细胞的增殖,在体内可提高皮肤缺血损伤后的修复和愈合。金惠民等[6]研究表明,在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型中,丹酚酸B 显著增加缺血再灌注后bcl-2 蛋白表达,同时显著降低bax 蛋白的表达,提示丹酚酸B 可通过上调bcl-2 蛋白及下调bax 蛋白的表达,并恢复二者的比例,从而调节它们抗凋亡和促凋亡作用,发挥脑缺血再灌注损伤后的神经保护作用。这可能是丹酚酸B 防治缺血性脑血管疾病的机制之一,通过调节它们抗凋亡和促凋亡作用来发挥脑缺血再灌注损伤后的神经保护作用。
1.3 对兔肢体缺血再灌注损伤代谢酶的影响 缺血再灌注损伤(IRI)是指组织缺血后的再灌注并不能缓解组织的损伤,而是加重组织细胞的代谢障碍和结构破坏,骨骼肌对缺血损伤非常敏感。正常肌细胞内含丰富的乳酸脱氢酶(LDH)和血清肌酸激酶(CK),细胞损伤早期,肌膜通透性增高,细胞内的酶释放入血,血清中的酶即发生相应改变,随着肢体损伤程度的加重,释放入血的酶进一步增加。因而血清中这些酶的含量可作为肌细胞损伤的敏感指标,其含量的高低可反映细胞损伤的程度。当组织缺血时,有氧代谢途径受阻而变为无氧代谢,乳酸、乳酸盐大量增加,对细胞造成损害,细胞膜完整性破坏,钾离子、细胞内酶及蛋白质外漏,血中肌酸磷酸激酶、乳酸脱氢酶等升高明显,是检查骨骼肌损伤的重要指标,而骨骼肌是对缺血最为敏感的组织之一。涂泽松等[7]建立兔肢体缺血再灌注损伤模型,在缺血前和再灌注4 h 抽血检测LDH和CK,实验结果显示,缺血再灌注4 h 血浆中CK 和LDH 显著增高,表明组织细胞膜完整性遭到破坏,细胞内酶外漏,骨骼肌大量损伤。而在预先应用高氧液和丹酚酸B 后,相对于对照组可以明显降低CK 和LDH,证实两者可保护细胞膜的完整,减少细胞内酶及蛋白质等释放入血,减轻细胞内外的微环境的失衡状态,减轻组织细胞的损伤。这与病理结果中所见相对于对照组,其他组骨骼肌损伤程度较轻的情况一致,而且高氧液和丹酚酸B 存在协同作用。
2.1 保护肾脏,抗肾纤维化在致纤维化的多种细胞因子中,转化生长因子(TGF)-β1 被认为是最重要的致纤维化因子,TGF -β1 诱导的肾小管上皮细胞转分化是导致进展性肾小管间质纤维化的重要环节。肾脏损伤使TGF-β1 等多种细胞因子产生增加,一定浓度的TGF -β1 可诱导肾小管上皮细胞向间质肌成纤维细胞转分化。
芮国华[8]在以TGF -β1 刺激培养的近端肾小管上皮细胞系(HK-2)细胞培养基中同时加入丹酚酸B后,无论在基因水平还是在蛋白水平,HK-2 细胞α -平滑肌肌动蛋白(α -SMA)的表达均得到明显抑制,与此同时,HK-2 细胞E-cadherin 的表达和细胞形态的改变也得到明显的恢复,表明丹酚酸B 能够有效阻止TGF-β1 诱导的HK -2 细胞的EMT,维持正常肾小管上皮细胞的结构和功能的完整性。丹酚酸B 抗肾间质纤维化的作用主要与其能够有效阻止肾小管上皮细胞的转分化相关。
陆海英等[9]通过大鼠单侧输尿管结扎术(UUO)建立肾间质纤维化动物模型,观察丹酚酸B 治疗后肾间质病理变化,结果显示丹酚酸B 治疗组明显减轻肾小管的扩张和萎缩,减轻肾间质的细胞增生;丹酚酸B能明显改善大鼠的血尿素氮水平(P <0.05),明显降低肾组织的羟脯氨酸含量,提示丹酚酸B 能有效防治肾纤维化。
周娟等[10]研究发现,丹酚酸B 能够明显改善梗阻性肾病的病理改变,减轻肾脏纤维化程度。丹酚酸B治疗组与模型组相比,在造模后14 d 显著减少了肾组织α-SMA 的表达,间质中α-SMA 的减少尤其明显。造模后21 d,组织中α-SMA 阳性面积虽未减少,但是可以观察到丹酚酸B 治疗组保留了许多肾小管结构。同时,丹酚酸B 能够显著增加肾组织中角蛋白19 -mRNA 的表达。
2.2 抗肝损伤、肝纤维化 肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活是肝纤维化形成的核心环节。转化生长因子-β(transforming growth factorβ,TGF -β)是目前研究最深入的与肝脏疾病密切相关的细胞因子,是调控肝纤维化发生发展的核心物质。肝贮脂细胞(FSC)是一种肝脏实质细胞,在病理条件下被激活后大量增殖,同时产生细胞外基质的能力增长数十倍,因此,FSC 在肝纤维化形成过程中也起到了重要作用[11]。近年研究认为[12],肝纤维化是一种整体损伤愈合反应,脂质过氧化与基质金属蛋白酶(MMPs)活性改变等可导致肝组织微环境破坏,在HSC 活化及肝纤维化病理形成中起重要作用。体外研究发现,丹酚酸B 可以抑制传一代培养的HSC 的增殖及胶原生成,以及抑制TGF-β 在HSC 中的信号转导[13]。另有研究表明,丹酚酸B 有良好的抗肝脏过氧化损伤作用和抑制MMP-2 活性,保护肝组织微环境,能明显减轻肝组织炎性损伤与胶原纤维沉积,改善模型大鼠血清肝功能,降低纤维化肝组织的羟脯氨酸含量,证实了丹酚酸B 具有良好的抗肝损伤与抗肝纤维化效果[14]。
2.3 抑制淀粉样β 蛋白的纤维形成 唐民科等[15]为观察丹酚酸B 对淀粉样β 蛋白的纤维形成及其细胞毒作用的影响,将不同浓度丹酚酸B 与淀粉样β 蛋白(1 -40)在25 ℃共同孵育,于不同时间取样品电镜观察纤维形成,结果丹酚酸B 10 ~100 nmol/L 可以完全抑制淀粉样β 蛋白(1 -40)25 ℃放置30 h 的纤维形成,对淀粉样β 蛋白(1 -40)25 ℃放置48 及100 h 的纤维形成也有明显抑制作用,表明丹酚酸B 可抑制淀粉样β 蛋白的老化及纤维形成。
3.1 抗神经细胞凋亡 研究表明,脑缺血及再灌注可造成神经元的死亡,在局灶性脑缺血和全脑缺血模型中,均有凋亡的发生,与神经细胞坏死同时并存。有别于细胞坏死,凋亡是受基因调控的一种主动性细胞自我消亡过程,是迟发性神经元死亡的主要形式。在脑缺血时,细胞凋亡发生的机制为脑缺血、缺氧引起一系列损伤反应,包括ATP 能量衰竭、兴奋性氨基酸毒性、氧自由基生成增多、细胞内钙超载等。这些损伤反应触发细胞的凋亡相关分子生成,并在其综合作用下逐步发生细胞凋亡。
赵旭等[16]为观察丹酚酸B 对大鼠局灶性脑缺血再灌注时神经细胞凋亡的影响及其可能的分子机制,将健康雄性Wistar 大鼠随机分为假手术组、模型组和丹酚酸B 组;线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型;分别采用原位细胞凋亡检测技术和免疫组化方法,利用病理图像分析系统测定脑组织细胞凋亡指数(AI)以及bcl-2 和bax 蛋白表达量,应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组大鼠脑组织bcl-2和baxmRNA 相对表达量。结果丹酚酸B 组较模型组bcl-2 表达增加,bax 表达减少,提示丹酚酸B 可通过上调bcl-2 表达及下调bax 表达,从而调节它们抗凋亡和促凋亡作用,最终减少神经细胞凋亡。
3.2 促进神经干细胞增殖、突起生长和分化郭国庆等[17]为揭示丹酚酸B 如何影响神经干细胞的生长,采用MTT、流式细胞术、免疫荧光和RT -PCR 技术检测丹酚酸B 对胎鼠大脑皮质神经干细胞增殖、突起生长和分化的作用,结果20 和40 μg/ml 丹酚酸B 对促进神经干细胞增殖的作用相似,适量的丹酚酸B 可促进神经干细胞增殖并形成较多的神经干细胞球,其促增殖作用通过提高G2/S 期细胞的数量而实现。丹酚酸B 还可促进神经干细胞球发出较多的突起并分化出较多的成熟神经元,分化开始时,tau GFAP 和nestin mRNA 均有表达,但分化后的细胞与对照组比较,tau mRNA 表达增多,而GFAPmRNA 表达减少,说明外源性的丹酚酸B 具有促进神经干细胞增殖并向神经元分化的作用,有望成为一种获取更多神经干细胞和促进神经干细胞分化的药物。
目前糖尿病动脉粥样硬化的患病率显著增多,已经成为糖尿病发病率和致死率最高、危害最大的慢性并发症。鲍丽颖等[18]通过观察丹酚酸B 对链脲霉素(STZ)联合高脂饲养ApoE- / -小鼠主动脉Bcl-2 和Bax 蛋白表达的影响,探讨丹酚酸B 防治糖尿病动脉粥样硬化的作用机制。结果表明丹酚酸B 能上调Bcl-2蛋白表达以及下调Bax 蛋白表达,并恢复二者比值,可能是丹酚酸B 防治糖尿病动脉粥样硬化的作用机制之一。
顾立彦等[19]率先选用中药单体丹酚酸B 进行ApoE 小鼠糖尿病动脉粥样硬化的研究。该项研究经病理学观察及计算机图像分析显示,ApoE 基因敲除小鼠在腹腔注射STZ 诱导的前提下给予高脂饲料,短期内形成与人类2 型糖尿病类似的糖尿病动脉粥样硬化模型,其动脉壁上可见到明显的动脉粥样硬化病变,给予丹酚酸B 则可减轻其动脉粥样硬化病变程度,维持血管壁弹性并显著缩小动脉粥样硬化斑块面积,且通过与洛伐他汀组对比无差异性,提示丹酚酸B 具有减轻糖尿病动脉粥样硬化作用。其机制可能与其调脂、抗氧化、保护血管内皮等作用有关。
5.1 抗衰老 线粒体DNA 易受到氧化自由基产物的攻击,产生大量的突变,产生缺陷DNA,肌体可能通过代谢反馈机制增加细胞和线粒体的含量进行代偿。高辉等[20]为研究丹酚酸B 的抗衰老作用及作用机制,将30 只2 月龄小鼠随机分为青年组、模型组及丹酚酸B组,皮下注射D-半乳糖造成衰老模型,同时丹酚酸B组每日腹腔注射丹酚酸B 22.5 mg/kg,6 周后进行跳台和水迷宫实验,并处死小鼠检查脑组织SOD、MDA及线粒体DNA。结果丹酚酸B 组小鼠跳台和水迷宫实验成绩均明显优于模型组,脑组织SOD 活力提高、MDA 的含量降低,线粒体DNA 的量显著降低,表明丹酚酸B 具有抗衰老作用,推测可能是通过抗氧化及影响线粒体DNA 而发挥作用的。丹酚酸B 处理组与衰老模型组比较,脑细胞mtDNA 相对含量明显降低,提示丹酚酸B 具有保护脑细胞mtDNA 的作用。而丹酚酸B 抑制mtDNA 含量的增加可能也与其抗氧化作用有关。丹酚酸B 可能通过清除衰老过程中不断增加的自由基和抑制脑组织mtDNA 含量增加,抑制脑组织脂质过氧化反应,延缓衰老引起的脑组织生理生化功能的改变,从而改善衰老所致的学习记忆功能障碍。
5.2 内皮细胞保护功能 血管内皮细胞(VEC)为衬贴于心血管内腔面的单层扁平细胞,是血管壁与血液之间的分界屏障细胞。目前,人们认为VEC 的生物学功能除作为屏障外,还是高度活跃的代谢库,具有一定的抗栓功能,能合成多种血管活性物质,在血管舒缩、凝血与抗凝、血液的流动性等多方面有不可替代的调节作用。VEC 的损伤和功能异常与多种疾病的发生相关或为始动环节,尤其在心脑血管性疾病发病过程中起到重要作用[21]。Zhou 等[22]研究发现,丹酚酸B 可通过影响NF-kappaB 和ERK -AP -1 通路而降低由TNF-α 介导的HUVEC 表面的PAI -1 的表达。从分子水平上进一步探求了丹参对VEC 抗凝作用影响的机制。实验研究表明丹酚酸B 预处理可抑制大鼠心肌缺血再灌注损伤过程中的钙离子超载,减少内皮素(ET)及TNF - α 的释放、改善血栓素/前列环素(TXA2/PGI2)系统的平衡状态、降低缺氧/复氧损伤后内皮细胞细胞间黏附分子的表达,起到保护内皮细胞的作用,同时对脂质氧化、巨噬细胞向内皮下迁移起到一定的抵抗作用。
5.3 血管舒张作用 丹参水提物还可以增加人脐静脉内皮细胞NO 合成酶启动子的活性,上调内皮细胞中NO 合成酶的mRNA 和蛋白水平[23]。而丹酚酸B对于猪冠状动脉平滑肌细胞的作用则不涉及对NO 合成酶功能的影响,而是通过鸟苷酸环化酶的作用激活了细胞膜上离子通道的开放实现的[24]。这可能是由于丹参水提物对于不同细胞类型具有不同的作用引起的。
5.4 抗肿瘤作用 程铎等[25]研究发现,用红色荧光量子点(QDs)与丹参中的水溶性成分丹酚酸B 进行了连接,通过QDs 的荧光示踪,发现丹酚酸B 可结合到肺腺癌细胞(SPCA-1)和肝癌细胞(7721)上,并可进入细胞内部。在此结果的提示下,进行细胞增殖抑制实验,进一步发现丹酚酸B 对上述两种细胞有增殖抑制作用。实验表明,丹酚酸B 对这两种肿瘤细胞可能有多个作用靶点。Hao Y B 等[26]研究发现,在体外用丹酚酸B 处理后,头颈部鳞癌细胞(HNSCC)的生长和增殖受到明显抑制。并在体内实验中发现,丹酚酸B能显著抑制接种于裸鼠体内的头颈部鳞癌组织,其机制可能与抑制COX-2、前列腺素E2 的表达有关。
5.5 增强成骨作用,促进生物陶瓷和骨之间表面的黏合 丹酚酸B 通过刺激成骨细胞的碱性磷酸(酯)酶(ALP)活性和减少破骨细胞的数目及缩小细胞来防止骨成分丢失[27]。低剂量的丹酚酸B 通过刺激成骨细胞总的代谢活性和ALP 活性来改善骨愈合,原儿茶醛剂量依赖性抑制骨髓细胞数量,丹参酮ⅡA 通过抑制破骨细胞的分化和活性而减少骨成分吸收[28,29]。
丹酚酸B 作为丹参主要有效成分已经证实具有多方面的药理活性,但其生物利用度,在大鼠体内生物利用度为2.3%[30],限制了其临床应用,如何提高其生物利用度,具有理论和实际意义。
1 黄健男,张瑞岩. 基质金属蛋白酶在心肌缺血再灌注损伤中的作用. 现代生物医学进展,2011,11(13):2584
2 孙建军,刘树恒. 试述心肌缺血再灌注损伤及药物治疗进展. 医学信息,2011,24(9):5971
3 赵桂峰,张红霞,范英昌. 丹酚酸B 对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用.辽宁中医学院学报,2004,6(1):55
4 李琴,韩力培,李泽慧,等.丹酚酸B 通过抑制MAPK 通路减轻大鼠脑缺血再灌注引起的血脑屏障损伤. 药学学报,2010,45(12):1485
5 Lay I S,Hsieh C C,Chiu J H,et al. Salvianolic acid B enhancesin vitroangiogenesis and improves skin flap survival in Sprague - Dawley rats. J Surg Res,2003,115:279
6 金惠民,赵承梅,赵旭,等. 丹酚酸B 对局灶性脑缺血再灌注大鼠bcl-2和bax 蛋白表达的影响.中华中医药学刊,2008,26(7):1475
7 涂泽松,陈志维,李逸群. 丹酚酸B 和高氧液对兔肢体缺血再灌注损伤代谢酶的影响.河南外科学杂志,2010,16(4):1
8 芮国华,潘荣华,姚刚,等. 丹酚酸B 对TGF -β1 诱导的人肾小管细胞转分化的影响. 南京医科大学学报(自然科学版),2009,29(12):1685
9 陆海英,张悦,刘煜敏,等. 丹参酚酸B 对肾纤维化大鼠肾组织MMP-2表达的影响.上海中医药大学学报,2009,23(2):55
10 周娟,张悦,陆海英,等. 丹参酚酸B 盐对大鼠肾纤维化的影响. 中国中药杂志,2009,34(21):2790
11 尹音,王峰.丹酚酸B 研究进展.中国药师,2007,10(10):1034
12 Friedman S L,Rockey D C,Bissell D M.Hepatic fibrosis 2006:report of the third AASLD single topic conference. Hepatology,2007,45:242
13 Liu C,Liu P,Hu Y,et al.Effects of salvianolic acid-B on TGF-beta 1 stimulated hepatic stellate cell ctivation and its intracellular signaling.Zhonghua Yixue Zazhi,2002,82(18):1267
14 卢明芹,潘陈为,李骥,等.丹酚酸B 对肝纤维化大鼠TGF-pl、MMp-2 和TIMp-2 表达的影响. 世界华人消化杂志,2007,15(36):3847
15 唐民科,张均田.丹酚酸B 体外抑制淀粉样β 蛋白的纤维形成及其细胞毒作用.中国药理学报,2001,22(4):380
16 赵旭,范英昌,郭茂娟,等. 丹酚酸B 抗神经细胞凋亡的实验研究.实用老年医学,2008,22(2):108
17 郭国庆,李斌,王圆圆,等. 丹酚酸B 促进胎鼠大脑皮质神经干细胞增殖、突起生长和分化. 中国科学·生命科学,2009,39(8):793
18 鲍丽颖,范英昌,顾立彦,等. 丹酚酸B 对STZ 联合高脂饲养ApoE- / -小鼠主动脉Bcl-2 Bax 蛋白表达的影响. 辽宁中医药大学学报,2010,12(11):35
19 顾立彦,王宇春,范英昌,等.丹酚酸B 对ApoE 小鼠糖尿病动脉粥样硬化治疗作用.天津中医药,2009,26(5):420
20 高辉,何玲,李春艳,等. 丹酚酸B 对衰老小鼠学习、记忆的影响及作用机制研究.食品科学,2009,30(19):294
21 高永峰,朱玉云,高允生. 丹参对血管内皮细胞药理作用的研究进展. 泰山医学院学报,2007,6(28):474
22 Zhou Z,Liu Y,Mao A D,et al. Salivialic acid B attenuates plasminogen activator inhibitor typeⅠproduction in TNF - alpha treated human umbilical vein endothelial cells. Cell Biochem,2007,96(1):109
23 Katja S F,Larissa B,Natalie V,et al. Ursolic acid from the Chinese herb Danshen(Salvia miltiorrhiza L)upregulates Enos and downregulates Nox4 expression in human endothelial cells.Atherosclerosis,2007,195:104
24 Lam F F Y,Seto S W,Kwan Y W.Activation of the iberiotoxin sensitive BKCa channels by salvianolic acid B of the porcinecoronary artery smooth muscle cells.Eur J of Pharmacol,2007,546:28
25 程铎,储茂泉,宋馨,等.应用量子点纳米探针研究丹酚酸B 与肿瘤细胞间的直接作用.中国药学杂志,2007,42(18):1389
26 Hao Y B,Xie T P,Alexandru K,et al. Salvianolic acidB inhibits growth of head and neck squamous cell car-cinoma in vitro and in vivo via cyclooxygenase-2 andapoptotic pathways. Int J Cancer,2009,124(9):2200
27 崔燎,邹丽宜,刘钰瑜,等.丹参水提物和丹参素促进骨细胞活性和防治泼尼松所致大鼠骨质疏松.中国药学通报,2004,20(3):286
28 Liu Y R,Qu S X,Maitz M F,et al.The effect of the majocomponents of Salvia miltiorrhiza Bunge on bone marrow cells. J Ethnopharmacol,2007,111(3):573
29 Lee S Y,Choi D Y,Woo E R.Inhibition of osteoclast differ entiation by tanshinones from the root of Salvia miltiorrhiza Bunge .Arch Pharm Res,2005,28(8):909
30 Kim C K,Cho Y J,Gao Z G.Preparation and evaluation of salvianolic acid B micro emulsions for oral delivery.J Controlled Release,2001,70(1 -2):149