沙棘黄酮提取进展

彭 游，汤 明，胡小铭，邓泽元2

1九江学院应用化学研究所，九江332005;2南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌330047

沙棘黄酮提取进展

彭 游1，2*，汤 明1，胡小铭1，邓泽元21

1九江学院应用化学研究所，九江332005;2南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，南昌330047

沙棘黄酮是食药两用植物沙棘主要的保健与药用成分，具有重要的生理活性，能够清除体内的自由基，防治心血管疾病和抗衰老的作用。本文概述了国内外对沙棘资源的开发利用研究状况，综述了沙棘黄酮类化合物提取方法的最新研究进展，为充分利用沙棘资源和开发沙棘黄酮提供科学研究基础。

沙棘;黄酮类化合物;提取

Abstract:Seabuckthorn flavonoids are a major healthcare and pharmaceutical ingredients of seabuckthorn.They have important physiological activities that can remove free radicals，treat cardiovascular disease，and be anti-aging.To provide scientific basis for utilizing of sea-buckthorn resources and exploration of seabuckthorn flavonoids，an overview of sea buckthorn flavonoids extraction of the latest research advances was completed in this paper.

Key words:seabuckthorn;ketone category compound;extraction

沙棘(Hippophae rhamnoides Linn)是胡颓子科(Elaeagnaceae)多年生落叶乔木或灌木，能防风固沙、保持水分和改良土壤，具有优良的生态效益。沙棘的果实被誉为第三代水果，营养价值高，药用价值也被广泛认同。20世纪90年代以来，国内外对沙棘进行了大规模的开发利用和较深层次的研究［1-3］。

从20世纪50年代到80年代，前苏联有9项沙棘研究成果获得国家专利，其中药用油已广泛投入医用。1995年日本从沙棘油中精制提取出了最新的抗癌针剂药物。近年来，我国对沙棘的药用研究比较活跃，相继研究报道了沙棘提取物在抗癌治癌方面的功效以及对心脑血管疾病、烧伤等的治疗作用［4］。如今，沙棘已被视为宝贵的药用植物，随着对沙棘资源开发和研究的深入，人们发现在沙棘果肉中所含的沙棘黄酮在治疗和缓解人类的某些疾病，如抗心肌缺血，抑制动脉粥样硬化，降低血中胆固醇，抗心律失常等方面具有明显的疗效［4-7］。本文主要对沙棘中黄酮类化合物的提取方法进行综述。

1 溶剂提取法

对于沙棘黄酮类化合物利用水、醇等传统溶剂的提取方法，国内外做了充分研究，但每年仍有不少相关报道［8-26］，主要分为沙棘总黄酮与花青素的提取。现仅对沙棘黄酮类化合物的传统溶剂提取法进行简要综述。

刘锡建［8，9］等人采用正交实验法确定了沙棘果渣总黄酮提取的最佳条件:石油醚脱脂，65%的乙醇溶液作提取剂，温度80℃，提取3次(1 h/次)，料液比为1∶8(W/V)，沙棘果渣提取总黄酮得率高达5.344 mg/g。实验结果还表明X-5树脂可以很好的精制沙棘总黄酮。通过5倍体积总黄酮溶液时，吸附率为96.2%，再用3倍体积75%的乙醇基本能把吸附在X-5树脂上的沙棘总黄酮洗脱下来，洗脱率为96.5%，产品真空干燥后纯度达到23.0%(市场要求不低于20%)。提取和精制工艺流程为:沙棘果渣→石油醚脱脂→干燥→乙醇提取→提取液→回收乙醇→醇沉→离心→回收乙醇→黄酮水溶液→X-5树脂吸附→75%乙醇洗脱→洗脱液→回收乙醇→干燥→黄酮产品。

阮栋梁［10］等人利用硅胶柱和葡聚糖凝胶柱层析，结合1H NMR与13C NMR等结构鉴定手段，从沙棘叶中分离得到芹菜素(Ⅰ)与山柰酚(Ⅱ)。分离纯化路线为:沙棘叶→石油醚脱脂→甲醇提取→回收甲醇→浓缩液→正己烷萃取→母液→浓缩→干燥→黄酮粗品→硅胶柱层析→葡聚糖凝胶柱层析→乙醇重结晶→结构鉴定→化合物Ⅰ和Ⅱ。芹菜素在沙棘黄酮中含量较高。由于沙棘黄酮为一类多羟基化合物，大多容易吸附在硅胶柱上，难以洗脱，所以最终仅有芹菜素与山柰酚被分离纯化。

王振宇［11］等人采用溶剂法提取大果沙棘总黄酮，并在单因素试验基础上，利用响应面分析法考察乙醇的体积分数、提取的温度、液固比和提取时间对总黄酮得率的影响，并对提取工艺进行优化。最佳提取条件:提取温度 61.85℃，乙醇体积分数71.36%，提取时间为 2.59 h，液固比(V/m)为18.33 mL:1 g，此条件下黄酮得率为0.741%。经响应面设计法优化后，可以找到各因素的最佳值并获得较理想的得率;同时，各个因素间的相互作用对生产过程中工艺参数的设置提供了参考。

陈雏［12］等人采用乙醇渗漉从沙棘果实中提取总浸膏，经不同溶剂萃取，硅胶、聚酰胺低压柱层析等方法分离并进行结构鉴定。分离鉴定出的化合物为:异鼠李素、槲皮素、异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷和芦丁等成分。其中异鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷为首次从中国沙棘果实中分离得到的黄酮化合物。

徐晓云［13］等人以脱脂沙棘籽为原料，乙醇为提取液，通过提取温度、提取时间、脱脂时间、料液比、酒精浓度和pH值6个单因素实验，在中心组合实验基础上，采用响应面分析法，确定沙棘籽中原花色素的最优提取条件。在提取温度21℃、pH 5.1以及酒精浓度65%时，沙棘籽中原花色素的提取率达5.84%(以脱脂沙棘干重计)，粗品纯度达39.18%。

邸多隆［20］等人以浸膏得率和总黄酮含量为评价指标，利用L9(34)正交试验优选出沙棘叶总黄酮水提工艺最佳条件为8倍量水(w/v)回流提取2次，每次2.0 h;醇沉工艺最佳条件为:提取药液浓缩至相当于原生药1.0 g/mL，缓慢加入6倍量(w/v)80%乙醇溶液。此提取工艺可为新药研究和工业化制剂生产提供参考。李辰［21］等人利用类似水提醇沉法提取沙棘叶黄酮，还考察了5种大孔吸附树脂(HPD600、YWD01G3、YWD01F、07C 和 AB-8)对沙棘叶黄酮苷元的静态吸附/解吸附性能。实验结果表明:非极性树脂YWD01G3在吸附/解吸附方面显示出最佳的综合性能，对槲皮素、山奈酚、异鼠李素的平均吸附率和解吸附率分别为90.81%和59.51%。该实验为初步确定沙棘叶黄酮纯化用大孔树脂和进一步研究其动态吸附/解吸附提供了依据。

从以上文献可知，传统溶剂提取法中前处理主要采用石油醚脱脂，提取溶剂有水、甲醇水溶液等，但大多采用乙醇水溶液提取黄酮类物质。乙醇的浓度在50% ～80%之间，在提取中考虑pH是必要的，碱性条件更利于低分子量黄酮的溶解，纯化一般采用大孔吸附树脂等。传统溶剂提取法同其它比如微波萃取，超声辅助提取等方法相比，一般具有操作及设备简单，成本低，见效快，易于工业化等优点，但存在资源消耗大等不足。

2 分子烙印技术辅助提取法

共价分子烙印技术基本原理是:在含有大量交联剂的溶液体系中，模板分子(TMP)和功能单体以非共价作用(如氢键作用、离子对相互作用等)形成主客体配合物，通过引发功能单体和交联剂的聚合反应，形成高度交联高分子刚性骨架，得到分子烙印聚合物(MIP);当以一定方式消除功能单体和模板分子间的作用，在模板分子从MIP中流出的同时，留下了和模板分子构型类似的孔穴和相应的可作用位点。因此，MIP将对TMP及和TMP具有类似结构和官能团的物质呈现出预期的选择性和高度的识别功能［27-29］。

周力［27］等人制备了以槲皮素为模板的MIP，从沙棘粗提物中分离槲皮素和异鼠李素，取得良好效果。表明以槲皮素为模板的MIP可有效地从沙棘粗提物中分离槲皮素和异鼠李素，同时也预示着分子烙印技术在中药有效成分提取中所具有的良好前景。提取分离流程为:MIP的合成→干燥→反复洗涤→干燥→槲皮素MIP→装柱(用于分离沙棘黄酮);沙棘粗提物酸水解→旋干→甲醇定容→沙棘水解物溶液→加载于分离柱→甲醇洗脱→甲醇-醋酸洗脱→HPLC检测。

中药成分的多样性导致其有效成分的提取过程十分繁琐，应用分子烙印聚合物的这种特异亲合性，针对某一类成分进行直接提取，简化步骤，但该技术可行的前提条件是中药功效成分能和合适的功能单体形成如氢键、离子对等分子间作用，这也体现了分子烙印技术应用中存在的局限性。

3 超临界流体萃取法

廖周坤［30］等人应用超临界CO2萃取技术对从去脂后的沙棘果渣中提取总黄酮(以异鼠李素计)的工艺进行研究，用均匀设计法优化出最佳工艺。实验表明，利用超临界CO2萃取技术(CO2-SFE)所得的总黄酮的提取率为传统溶剂提取工艺提取率的1.245倍。夹带剂中乙醇浓度增加时，其提取率也随之增加，但当用95%乙醇作夹带剂时，其提取率反而下降，可以看到，异鼠李素的提取率与夹带剂浓度呈抛物线状关系。加入一定极性夹带剂后，CO2-SFE有较高提取率，在于混入该夹带剂的超临界CO2流体在药材中的扩散速度、扩散深度及其与被提取物质分子间的作用力与传统溶剂萃取法相比有明显改善。并且在加夹带剂的CO2-SFE中，夹带剂的极性可灵活选择，以适应于各种极性溶质的提取。

CO2-SFE是一种可以在较低温度条件下进行有效成分的提取方法，有利于保护有效成分免于破坏，但用这种方法一步完成植物药的单体分离，一般是不可能的，事实上也没有哪种方法能做到。目前对粗提物用制备色谱或HSCCC，结合重结晶反复纯化才可能得到纯品。然而CO2-SFE却有可能创造出一般溶剂萃取达不到的条件，大幅度改善有效成分的提取率和最终收率，特别是对贵重药材的有效成分的提取上，很有工业开发价值。

4 超声波辅助提取法

祖元刚［31］等人以沙棘叶为原料，通过正交实验优化了沙棘总黄酮的超声波提取工艺，考察了超声波作用时间、超声温度、液料比和提取次数4个因素对沙棘叶总黄酮提取率的影响。确立的工艺条件为:提取溶剂85%乙醇，液料比25/1(mL/g)，超声波温度46℃，作用时间25 min，提取1次。结果表明，超声波提取沙棘总黄酮的提取率为1.72%，与索氏提取的提取率相当，但超声波提取具有时间短，提取溶剂用量少的明显的优势。通过逐步回归对沙棘总黄酮超声波提取的过程进行了数学模拟，其回归方程能较好地模拟实际提取过程，可以对未知提取过程进行预测［32］。

马养民［33］等人利用超声技术从棘果渣中分离出异鼠李素和槲皮素两个黄酮类化合物，实现了沙棘废料的有效利用。提取最佳工艺参数:提取液乙酸乙酯与95%乙醇之比为3∶7(V/V)，料液比为1∶10(W/V)，在温度50℃条件下超声30 min。提取的总黄酮经二次硅胶柱梯度洗脱，一次葡聚糖凝胶柱层析以及多次重结晶得到纯品，经UV、1H NMR以及IR进行分析鉴定为异鼠李素和槲皮素，异鼠李素得率为0.55%。由于该法在纯化过程中采用了硅胶柱层析，具有5个羟基的槲皮素更容易被吸附在载体上，难以洗脱下来，因此收率不如异鼠李素高。该分离纯化法较适宜沙棘中异鼠李素的分离。

焦翔等［34］以中国青海产中国沙棘叶和内蒙古产大果沙棘叶为原料，分别选择水与乙醇作提取溶剂，以超声波辅助浸提提取。采用紫外-可见光分光光度法测定了提取物的总黄酮含量，采用管碟法和试管两倍稀释法测定提取物对13种常见食品污染微生物的抑制效果。结果表明，青海产中国沙棘叶提取物的总黄酮含量和提取物抑菌活性均优于内蒙古产大果沙棘叶;乙醇提取物总黄酮含量和抑菌效果均显著优于水提取，作者认为超声辅助提取有助于保持提取物的抑菌活性。

姜少娟等［35］采用超声波提取法从沙棘果渣中提取总黄酮，以正交试验法确定了总黄酮的最佳提取工艺，并与传统溶剂回流提取法进行了比较。超声提取沙棘果渣总黄酮的最佳提取工艺为，提取液为3/7(乙酸乙酯/体积分数95%乙醇，V/V)，料液比(W/V)为1/10，在温度50℃下提取30 min。提取方法的比较结果表明，超声提取法优于传统回流提取法，超声提取法大大节省了提取所需的时间，降低了生产成本，提高了经济效益，为开发利用沙棘果渣提供了有益的参考。

杨喜花等［36］研究了超声循环技术在沙棘叶总黄酮提取中的应用。对乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等不同提取溶剂的提取效果进行比较得出乙醇是超声提取沙棘叶总黄酮的最佳溶剂。采用索氏、超声与超声循环方法提取总黄酮的实验表明，超声循环提取法可提高沙棘叶中总黄酮的提取效率，超声循环提取10 min已经达到了索氏提取6 h的效果。作者认为，75%乙醇用于不同提取方法提取沙棘叶总黄酮，均为溶剂的最佳体积分数。超声循环提取的效果明显优于普通超声提取与索氏提取。超声提取与索氏提取相比，节约了时间和能耗，且提取工作在室温下进行，可避免高温对提取成分的影响。

超声波技术在天然产物提取中已显示出巨大的优势，原理是利用超声波产生的强烈振动、空化效应、搅拌作用等可以加速植物有效成分进入溶剂，提高提取效率，缩短提取时间，简化操作步骤。但值得注意的是，对于超声乙醇提取这个方法，仍需加大研究，本着节省能源、溶剂和时间，简化操作与尽量多保留与提取天然活性成分的原则，求得最优提取条件。

5 微波/光波提取法

微波提取技术是天然产物提取中一种非常有发展潜力的新型技术。微波是一种频率在300 MHz～300 GHz之间的电磁波，具有波动性、高频性、热特性和非热特性四大基本特性。微波加热是靠穿透物质，使物体内部分子产生震动和摩擦，从而对物体加热，是由内向外的加热。在快速振动的微波电磁场中，被辐射的极性物质分子吸收电磁能，以每秒数十亿次的高速振动产生热能［37，38］。自 Ganglier等［39］最早利用微波萃取法从羽扇豆中提取鹰爪豆生物碱后，该技术成为天然产物提取的有力工具。

本课题组利用微波光波组合法提取茶皂素与沙棘果渣中的黄酮获得成功［40，41］。建立了用于辅助提取沙棘果渣黄酮的微波光波组合法，并初步阐述了微波提取黄酮的机理。研究表明，原料粉碎至0.022～0.056 mm，加入9.4%的 DMF 调匀，通过微波光波组合方式加热，功率为800 W(微波55%与光波45%)，加热8 min后，用200 mL乙醇分两次萃取总黄酮，纯化后提取率与常规方法提取相当。利用高倍荧光显微镜FM、IR等手段对微波提取机理进行初步研究，从微波对植物组织结构的影响上阐明次生代谢产物的微波提取机理。次生代谢产物如黄酮在植物细胞液泡中，微波辐照下，极性的黄酮分子高速旋转，破坏了黄酮分子与周围分子的分子间力平衡。液泡中介质沸腾冲破液泡，同时木质素细胞壁中的强极性分子糖类同样在微波下高速旋转，而破裂，从而有利于黄酮分子与组织的分离。

杨喜花等［42］研究微波技术在沙棘叶总黄酮提取中的应用，并为产业化生产提供试验性指导。采用单因素试验和正交试验考察不同因素对微波提取沙棘叶总黄酮的影响，优选提取工艺。最佳条件为微波辐照10 min，微波功率400 W，乙醇体积分数为75%，料液比1∶25(W/V)。研究表明，微波提取技术应用于沙棘叶总黄酮的提取，具有省时、高效、节能等优点。

赵二劳等［43］研究了表面活性剂增效微波提取沙棘叶黄酮工艺，筛选出了具有明显增溶效果的表面活性剂—椰子油脂肪酸二乙醇酰胺。实验确定的较佳提取工艺条件:以质量分数0.9%的椰子油脂肪酸二乙醇酰胺水溶液为提取剂，微波功率540 W，提取5 min，料液比为1∶40(W/V)。该工艺比仅用微波的提取率提高43.8%。表面活性剂协同微波提取沙棘叶黄酮，其提取率提高的原因可能是由于表面活性剂具有特定的双亲分子结构，可降低沙棘叶细胞膜与水溶液间的界面张力，更利于水溶液通过毛细管或细胞间隙渗透进入细胞壁内，溶解可溶的沙棘叶中黄酮，使细胞内外浓度差增大，水不断渗透进入细胞组织，提高细胞内部系统含水量。当采用微波技术协同提取时，细胞内溶液吸收微波后在短时间内能量快速上升，细胞内部压力提高，促使细胞膜内外两侧渗透压增大，细胞膜快速破裂，黄酮溶液比仅用微波法时更易流出，从而提高了它的浸出效能和提取率。在该方法中表面活性剂作为提取助剂的使用有一定的科学性，但要考虑其与产品的分离问题。

陈金娥等［44］研究了微波萃取法浸提沙棘黄酮与索氏浸提法最优工艺条件。通过单因素和正交实验法作了对比研究。索氏浸提法为温度75℃，时间6 h，固液比1∶20(W/V);微波法为功率180 W，时间 6 min，固液比 1∶10(W/V)，pH 值为 9.1。在最优条件浸提沙棘叶中的黄酮，两种方法的产率分别为3.697 mg/g和4.536 mg/g。微波萃取法黄酮产率高、省时、溶剂用量少、耗能低等优点。

6 酶辅助提取法

朱洪梅等［45］通过单因素和正交试验研究了纤维素酶辅助提取沙棘叶中黄酮类化合物主要影响因素，确定最佳提取工艺。各因素影响黄酮得率顺序依次为酶添加量＞酶解时间＞料液比＞酶解温度。最佳提取工艺为:酶添加量4%，料液比1/50(W/V)，酶解温度40℃，酶解时间2 h。工艺流程为:沙棘叶→烘干→粉碎→酶解→醇溶液浸提→取上清液→浓缩→粗产品。酶添加量对黄酮得率影响达到显著，是提取沙棘叶黄酮的主要影响因素。纤维素酶酶解预处理与醇提法相结合的提取工艺为沙棘叶总黄酮的提取提供了一种新方法，并且获得较好的效果。

纤维素酶可在半纤维素酶、果胶酶等的协同作用下，破坏植物的细胞壁，使细胞内容物裸露出来，可能有利于次生代谢产物黄酮等物质的溶解，因而提取率可能增加。但纤维素酶等酶的使用，也可能使植物内的活性成分分解丧失，达不到提取的目的。

7 匀浆法提取法

匀浆提取是指生物组织通过加入提取溶剂进行组织匀浆或磨浆，以提取活体组织中有效成分的一种提取方法。应用该方法对氨基酸、蛋白质和萜类物质进行提取的研究都有报道［46，47］，但将此方法应用到黄酮类成分提取方面的研究尚少见。应用匀浆法提取生物活性成分，可以直接将鲜物料置于匀浆机内，加入溶剂直接提取，此方法不但缩短了提取时间，而且省去了对物料进行烘干、粉碎的步骤。

赵春建［48］等人对利用匀浆法提取沙棘果中总黄酮的工艺进行了研究，确定了最佳的工艺参数:提取原料为含水率85%的沙棘果，溶剂为85%的乙醇，匀浆时间10 min，液固比为5∶1(mL/g)。将该法与常规的回流提取法进行了比较。结果表明，在优化的条件下，匀浆法对沙棘果总黄酮的提取率为0.76% ，与回流提取相当。

将含一定量水的鲜果与提取溶剂在匀浆提取装置中混合匀浆，通过机械及液力剪切作用将物料撕裂和粉碎，使物料破碎和有效成分的提取同步进行，以达到对植物有效成分快速、强化提取的目的。匀浆提取法较常规回流提取法具有提取率高、提取时间短、溶剂用量少、成本低的优点。匀浆提取省去了对物料进行烘干、粉碎的步骤，操作简单，对其它新鲜植物材料中天然产物的提取具有借鉴意义。但该方法依然存在能耗高，难以后处理的缺点。

8 展望

目前沙棘总黄酮的提取方法主要有水提法、有机溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法和超临界流体萃取法等。尽管传统溶剂提取法具有耗时耗能，消耗大量溶剂，经济与环境成本均很高等不足。但由于操作简单，人员设备要求不高，目前依然在工业生产中普遍使用，但在传统提取方法中，活性成分的纯化方法，活性成分种类以及成分的化学变化等应该成为进一步研究重点。超临界CO2萃取法提取速度快且安全性高，但目前国产的超临界萃取设备容积偏小，无法满足工业化生产的需要，而进口设备价格十分昂贵。微波辅助提取法选择性高、操作时间短、溶剂消耗量少，但设备泄漏的微波辐射会给人体造成慢性损伤。超声波辅助提取法提取效率高，提取时间短，但是超声波作用能断开碳—碳键，从而产生活性较强的自由基，破坏活性成分，降低提取物的稳定性。

综上所述，沙棘中活性成分的提取的研究远没结束，提取方法要避免过高的经济与环境成本，同时还要有利于资源的充分利用，以及产品的生物活性的保持与提高。

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Advances in Extraction of Flavonoids in Seabuckthorn

PENG You1，2*，TANG Ming1，HU Xiao-ming1，DENG Ze-yuan2

1Institute of Applied Chemistry，Jiujiang University，JiuJiang 332005，China;2Key Laboratory of Food Science of Ministry of Education，Nanchang University，Nanchang 330047

Q946.91;R284.2

A

1001-6880(2012)04-0562-07

2010-07-01 接受日期:2010-09-06

国家自然科学基金(81160412);江西省自然科学基金(2010GZN0106);江西省教育厅科技项目(GJJ11626)

*通讯作者 E-mail:trihydracid@126.com