热带剥爪螨变应原Blo t 5的克隆表达、纯化及免疫学鉴定①

蔡俊龙 杨 彬 邓宜红 陈 实 罗慕侠 李 勤 付永锋 程训佳

(复旦大学上海医学院病原生物学系，上海200032)

热带剥爪螨变应原Blo t 5的克隆表达、纯化及免疫学鉴定①

蔡俊龙 杨 彬 邓宜红 陈 实 罗慕侠 李 勤 付永锋 程训佳

(复旦大学上海医学院病原生物学系，上海200032)

目的:克隆热带剥爪螨主要变应原Blo t 5基因，表达纯化该蛋白，并检测其免疫活性。方法:提取热带剥爪螨总RNA，采用RT-PCR的方法扩增Blo t 5编码基因，将其连入原核表达载体pET-19b，将重组质粒转化入大肠杆菌BL21 Star (DE3)pLysS，IPTG诱导表达后，通过Ni2+亲和层析纯化重组变应原Blo t 5。用Dot blot、Western blot和ELISA等方法检测重组变应原Blo t 5免疫活性。结果:Dot blot和Western blot结果表明重组变应原Blo t 5和热带剥爪螨粗提液都能和Blo t 5鼠单克隆抗体结合。重组变应原Blo t 5检测69份热带剥爪螨过敏患者血清和21份户尘螨过敏患者血清中的特异性IgE，阳性率分别为29.0%和33.3%。结论:表达和纯化了具有与天然蛋白相似的免疫活性的重组热带剥爪螨变应原Blo t 5，可用于热带剥爪螨变应原的标准化，为标准化抗原的临床特异性诊断与治疗奠定基础。

热带剥爪螨;重组变应原;Blo t 5;蛋白表达;IgE

尘螨(Dust mites)普遍存在于人类居住和工作的室内环境中，因此也称屋尘螨(House dust mites，HDM)，其在世界范围内是过敏性疾病的主要危险因素之一[1]。流行病学资料显示，在全球范围内，蚍螨科的户尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)和粉尘螨(Dermatophagoides farinae)是最常见的螨种，而在热带和亚热带地区，甘(食)螨科的热带剥爪螨(Blomia tropicalis)是主要的螨种[2]。热带剥爪螨含有多种变应原，近年来，通过免疫印迹方法从热带剥爪螨中分离鉴别出至少25种变应原[3]。已正式命名的有 Blo t 1、Blo t 3、Blo t 4、Blo t 5、Blo t 6、Blo t 10、Blo t 11、Blo t 12、Blo t 13、Blo t 19 和 Blo t 21 等11种[4-11]。Blo t 5是热带剥爪螨的主要变应原，绝大多数热带剥爪螨过敏患者的血清IgE对它呈高反应性[12，13]，也有报导认为 Blo t 21也是主要的变应原[4]。至今，Blo t 5的生物学功能还不清楚。最近的研究发现Blo t 5主要存在于热带剥爪螨的中肠和后肠以及粪便中[4]。Naik等[14]用核磁共振的方法研究Blo t 5的结构，发现它的空间结构有两个很靠近的表位，分别有完整的抗体互补决定区(Complementarity-determining regions，CDRs)，有很好的抗原抗体结合性。本研究从培养的热带剥爪螨获得Blo t 5基因并在大肠杆菌中进行表达，建立大量制备并纯化具有天然免疫活性的重组变应原Blo t 5的方法，为特异性诊断与免疫治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 热带剥爪螨 本室分离并培养，培养采用封闭式容器，温度(25±2)℃，相对湿度75%。

1.1.2 质粒载体和表达菌 质粒载体pET-19b购自美国Novagen公司;大肠杆菌JM109感受态细胞购自大连TaKaRa公司;大肠杆菌BL21 Star(DE3) pLysS购自美国Invitrogen公司。

1.1.3 主要实验材料 Rneasy Total RNA kit购自德国Qiagen公司;GeneAmp RNA PCR Kit购自美国Perkin-Elmer公司;His-结合树脂购自 Novagen公司;Pyrobest DNA多聚酶、碱性磷酸酶(CIAP)、100 bp Ladder Maker、λHind Ⅲ DNA Markers、Ligation Kit、限制性内切酶 NdeⅠ和 XhoⅠ等购自大连TaKaRa公司;辣根过氧化物酶(HRP)偶联的山羊抗人IgE、HRP-山羊抗小鼠IgG购自Zymed公司;DAB底物显色试剂盒购自天根生化科技有限公司;引物合成与测序由上海Invitrogen公司完成;抗Blo t 5鼠单克隆抗体1E1、6A11和1C10由本实验室自制，4℃保存;热带剥爪螨过敏患者血清和户尘螨过敏患者血清来自福建莆田人民医院和海南省人民医院，阴性血清取自健康志愿者，-20℃保存。

1.2 方法

1.2.1 热带剥爪螨粗提液的制备 活体热带剥爪螨以丙酮脱脂3次，继以乙醚脱脂4小时以上，离心弃上清，室温挥发干燥。脱脂后的螨体以1∶25(W/ V)加入PBS，冰浴超声后，4℃ 14 000 r/min离心20分钟，取上清。

1.2.2 重组表达质粒的构建 挑取克隆化培养的热带剥爪螨，按照Rneasy Total RNA Kit的使用说明，提取总 RNA;以 GeneAmp RNA PCR Kit进行RT-PCR，获得cDNA。根据GenBank公布的热带剥爪螨变应原Blo t 5的mRNA序列(U59102.1)设计特异性引物，并在引物5′端加上限制性酶切位点。上 游 引 物:5′-CCCATATGAAGAAGGATGATTTCCGAA-3′，含 Nde Ⅰ酶切位点;下游引物:5′-CCCTCGAGTTATTGGGTTTGAATATC-3′，含 Xho Ⅰ酶切位点。以cDNA为模板，PCR扩增编码热带剥爪螨变应原Blo t 5成熟肽段的基因片段。经纯化的PCR产物以NdeⅠ和XhoⅠ酶切后，插入pET-19b载体中构建表达质粒。然后将其转化入大肠杆菌JM109，将菌液涂布于LB琼脂板(含氨苄青霉素50 μg/ml)，37℃过夜培养后，提取质粒，进行双酶切鉴定与测序鉴定。

1.2.3 重组变应原 Blo t 5的表达 重组质粒pET19b-Blo t 5转入大肠杆菌BL21 Star(DE3) pLysS后，挑取单菌落入400 ml LB培养液中(含氨苄青霉素 50 μg/ml)，37℃振摇培养至 OD600约为0.5时，加入1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG)，37℃诱导3小时后，4℃ 10 000 r/min离心10分钟，收集细菌沉淀。超声后，12.5%SDS-PAGE电泳，观察结果。

1.2.4 重组变应原Blo t 5的纯化 参照Novagen公司的Ni-NTA His-Bind Resin使用说明，细菌沉淀中，加入20 ml Binding buffer，冰上超声后，加入200 μg/ml溶菌酶混匀，30℃振摇30分钟后，冰上超声，4℃ 14 000 r/min离心20分钟，上清液用Ni2+亲和层析法纯化蛋白。以12.5%的SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度。以BCA Protein Assay试剂盒测定蛋白浓度后，4℃冰箱保存。

1.2.5 Dot blot检测 参照杨柳等[15]法进行 Dot blot检测。分别将 2 μg 重组变应原 Blo t 5、5 μg 热带剥爪螨粗提液和2 μg重组隐孢子虫子孢子表面蛋白P23(rP23)加样于硝酸纤维素膜上，室温干燥。以含3%脱脂奶的PBS湿盒内室温封闭1小时。分别加鼠单克隆抗体1E1、6A11和1C10，室温孵育1小时。分别加HRP-goat Anti-mouse IgG抗体(1∶250稀释)，室温孵育1小时。以DAB底物显色试剂盒显色20分钟。

1.2.6 Western blot检测 参照杨柳等[15]方法进行 Western blot检测。重组变应原 Blo t 5 0.1 μg、热带剥爪螨粗抗原5 μg和BSA 0.1 μg每道进行还原SDS-PAGE电泳后，电转到醋酸纤维素膜上。以含3%脱脂奶的PBS于湿盒内室温封闭1小时。分别加单克隆抗体1E1、6A11和1C10，室温孵育1小时。分别加HRP-goat Anti-mouse抗体(1∶250稀释)，室温孵育1小时。以DAB底物显色试剂盒显色，20分钟后终止反应，观察结果。

1.2.7 ELISA 检测 重组变应原 Blo t 5以0.05 mol/L、pH9.6 的碳酸盐缓冲液稀释至 5 μg/ml，每孔用0.1 ml包被酶标板，4℃过夜。以含1%脱脂奶的PBS于湿盒内室温封闭1小时。分别加热带剥爪螨、户尘螨过敏患者血清和健康体检者血清(1∶10稀释)37℃ 孵育 2小时。HRP-goat-Anti-Human IgE抗体室温孵育1小时。最终用OPD显色，反应30分钟终止反应。

1.3 统计学分析 以SPSS软件，采用成组t检验方法对热带剥爪螨、户尘螨过敏患者血清和健康体检者血清与重组变应原Blo t 5反应性进行统计分析。

2 结果

2.1 RT-PCR反应扩增Blo t 5基因 以RNA提取试剂盒提取热带剥爪螨的总RNA，通过RT-PCR反应扩增出Blo t 5蛋白编码基因，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，结果显示在350 bp左右处有明显条带，大小与理论值(355 bp)相符(图1)。

2.2 重组表达载体的构建与序列分析 经纯化的PCR产物以 NdeⅠ和 XhoⅠ双酶切后，插入pET19b表达载体中。表达载体pET19b-Blo t 5经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，电泳结果表明目标条带与Blo t 5基因片段的PCR产物大小一致。对Blo t 5基因片段进行测序鉴定，与GenBank中公布的序列(U59102.1)进行比对，结果表明Blo t 5基因片段与U59102.1 一致。

图1 Blo t 5基因PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳分析Fig.1 2%argarose gel electrophoresis analysis of PCR production of Blo t 5 gene

2.3 重组变应原 Blo t 5的表达 以重组质粒pET19b-Blo t 5转入大肠杆菌 BL21 Star(DE3) pLysS，挑取转化子培养，进行诱导表达，菌体经超声破碎后，进行SDS-PAGE分析，结果显示在分子量约为17 kD处有明显条带。重组蛋白主要以可溶形式表达，经His-结合树脂纯化后纯度可达99%以上(图2)。使用BCA Protein Assay试剂盒检测纯化后蛋白的浓度，结果表明每升培养液能够得到纯化重组变应原80 mg。

2.4 Dot blot检测 重组变应原Blo t 5蛋白和热带剥爪螨粗提液都可与单克隆抗体1E1、6A11和1C10特异性结合，而无关蛋白重组隐孢子虫子孢子表面蛋白P23无反应性(图3)。

图2 重组蛋白Blo t 5的SDS-PAGE分析图Fig.2 SDS-PAGE analysis of the recombinant Blo t 5

图3 目的蛋白Blo t 5的Dot blot鉴定Fig.3 Dot blot analysis of Blo t 5 protein

2.5 Western blot 经过还原条件SDS-PAGE转膜后，用单克隆抗体1E1、6A11和1C10分别作用于重组蛋白和天然蛋白，重组蛋白在17 kD处有明显条带，天然蛋白在14 kD处有明显条带(图4)。抗Blo t 5单克隆抗体可与重组热带剥爪螨变应原Blo t 5蛋白特异性结合。

图4 目的蛋白Blo t 5的Western blot鉴定Fig.4 Western blot analysis of Blo t 5 protein

图5 热带剥爪螨过敏患者、户尘螨过敏患者和健康体检者的血清对纯化后Blo t 5的反应性Fig.5 IgE-binding capacity of purified Blo t 5 to sera from patients allergic to B.tropicalis or HDM and health control

2.6 ELISA检测 用重组变应原Blo t 5检测69份热带剥爪螨过敏患者血清中的IgE，其中20份血清反应成阳性，阳性率为29.0%，表明重组变应原Blo t 5免疫活性良好。为了解重组变应原Blo t 5户尘螨过敏患者血清的反应性，用ELISA检测其IgE反应性，阳性率为33.3%，反应性略低于热带剥爪螨过敏的患者血清，差别没有统计学意义(P＞0.05，图5)。

3 讨论

在众多的变应原中螨类是最主要的变应原，花粉、真菌次之。螨变应原是引起变态反应性疾病的重要病因之一，也是引起儿童变应性哮喘的独立且重要的危险因子。尘螨主要包括户尘螨、粉尘螨和热带剥爪螨。在热带和亚热带地区热带剥爪螨为主要的螨种。陈实等[16，17]在海南进行的大规模人群的变应原皮肤点刺检测和过敏性哮喘患儿对螨类血清特异性IgE检测，发现对热带剥爪螨的阳性率高于85%。因此，热带剥爪螨变应原对于变态反应性疾病的诊断与治疗具有重要意义。但是粗提螨浸液成分复杂，含有不同比例的各种变应原或者非变应原，处理不当可能含有内毒素[18，19]，很难达到真正的标准化生产，同时也限制了其安全使用，而应用重组蛋白的技术可以解决这个问题。

免疫印迹法研究表明热带剥爪螨至少有25条与特异性IgE的结合条带，目前正式命名的有11种[4]。剥爪螨变应原Blo t 5是热带剥爪螨的主要变应原蛋白，可被大部分热带剥爪螨过敏患者血清中的IgE抗体特异性结合[4]。本研究中69份对热带剥爪螨过敏患者血清有20份对重组变应原Blo t 5反应成阳性，阳性率29.0%。重组变应原Blo t 5与热带剥爪螨过敏患者反应阳性率的差异，可能是由于不同的检测方法所导致。另外，对户尘螨过敏的患者血清对重组变应原Blo t 5的阳性率为33%，反应的平均值略低于对热带剥爪螨过敏患者血清，而两者间平均值差异没有统计学意义。这提示重组变应原Blo t 5与户尘螨变应原存在着交叉反应性。而有报道指出Blo t 5与Der p 5之间的序列同源性为 43%，有中度的免疫交叉反应性[20，21]。

本研究制备重组变应原Blo t 5采用的表达载体是pET19b载体，由于其所表达的重组蛋白带有His标签，在重组蛋白的N末端有10个组氨酸，便于蛋白的纯化而对重组蛋白生物学活性影响不大，因此重组变应原Blo t 5比天然蛋白分子量大2 kD左右。实验结果表明，重组变应原Blo t 5以可溶蛋白形式表达，表达量高，且通过Ni2+亲和层析就可以得到纯度很高的重组变应原Blo t 5蛋白。Dot blot中，重组变应原Blo t 5和天然蛋白都能被抗Blo t 5单克隆抗体特异性识别，证实重组变应原和天然蛋白有相同的抗原活性。Western blot检测显示重组变应原Blo t 5和天然Blo t 5具有相同的线性表位。可作为对热带剥爪螨过敏患者进行诊断和特异性免疫治疗的候选分子。

与天然蛋白相比，制备重组蛋白有周期短、成本低等优点。本研究从克隆化培养的热带剥爪螨中获得Blo t 5基因并在大肠杆菌中进行表达，制备纯化出具有天然免疫活性的重组热带剥爪螨变应原Blo t 5，实现热带剥爪螨变应原的标准化，为特异性诊断与免疫治疗打下了基础。同时由于重组变应原Blo t 5和户尘螨之间存在一定的交叉反应性，因而本研究也为热带剥爪螨与其他过敏原的交叉致敏反应的研究奠定了基础。户尘螨和热带剥爪螨过敏的患者进行脱敏治疗时，采用户尘螨和热带剥爪螨联合免疫治疗的疗效应该优于仅用户尘螨免疫治疗的疗效。

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[收稿2012-03-28 修回2012-05-09]
(编辑 倪 鹏)

Blomia tropicalis allergen Blo t 5:cloning，expression，purification and identification

CAI Jun-Long，YANG Bin，DENG Yi-Hong，CHEN Shi，LUO Mu-Xia，LI Qin，FU Yong-Feng，CHENG Xun-Jia.Department of Medical Microbiology and Parasitology，Shanghai Medical College of Fudan University，Shanghai 200032，China

Objective:To clone，express and purify the gene of the major allergen Blo t 5 from Blomia tropicalis and to investigate its immunological activity.MethodsThe total RNA was acquired from B.tropicalis，then the Blo t 5 gene fragments amplified by RT-PCR were cloned into vector pET-19b and then transformed to E.coli BL21 Star(DE3)pLysS.After inducted by IPTG，the recombinant Blo t 5 was purified by Ni2+chelating affinity chromatography.The immunological activity was identified by Dot blot，Western blot and ELISA.ResultsThe results of Dot blot and Western bolt showed both recombinant Blo t 5 and B.tropicalis extract can specially react with monoclonal antibodies against Blo t 5.The IgE antibodies from serum of 69 B.tropicalis allergic patients and 21 Dermatophagoides pteronyssinus allergic patients were tested.The result showed the positive rates were 29.0%and 33.3%，respectively.ConclusionWe have successfully obtained the recombinant allergen Blo t 5 with immunological activity similar to its native counterpart，which could not only resolve the standardization of natural allergen extracts but also contribute to the design of better strategies for the diagnosis and treatment of allergic respiratory diseases.

Blomia tropicalis;Recombinant allergen;Blo t 5;Protein expression;IgE

R392.8

A

1000-484X(2012)08-0690-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2012.08.004①本文受国家高技术研究发展计划项目(2007AA02Z472)和卫生行业科研专项项目(20082001)资助

蔡俊龙(1986年-)，男，在读硕士，主要从事过敏性疾病诊断与防治研究;

及指导教师:付永锋(1977年-)，男，博士，讲师，主要从事过敏性疾病诊断、防治和医学原虫的致病机制与分子生物学研究，E-mail:yffu@fudan.edu.cn。