香烟烟雾暴露对大鼠支气管肺泡灌洗液及外周血4-HNE和γ-GCS表达的影响

张 莉，许建英

（山西医科大学第一医院，太原 030001）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease COPD）是一种以气道不完全可逆性阻塞为特征的慢性炎症性疾病，吸烟是其发生发展的重要病因，氧化/抗氧化失衡为其主要的发病机制之一［1］。4-HNE是脂质过氧化反应醛基产物中最具代表性的物质［2］，在 COPD患者中，4-HNE水平的升高在肺部炎症的信号转导中发挥作用，导致炎症介质和保护性抗氧化基因表达的失衡。γ-GCS是谷胱甘肽合成过程中的限速酶，它的数量、活性等直接影响谷胱甘肽的水平［3］，有学者发现［4］吸烟所致COPD大鼠肺组织中 γ-GCS含量较之不吸烟大鼠明显增高，研究亦证实［5］4-HNE对大鼠肺泡上皮细胞中γ-GCS的合成有明显的促进作用，另有部分研究表明，γ-GCS在不吸烟者肺组织中较之吸烟者有更高的水平。以往对4-HNE和γ-GCS的研究多集中在细胞水平，本实验通过观察不同吸烟量、吸烟持续时间对大鼠BALF及外周血4-HNE和γ-GCS表达的影响及其相关性，探讨4-HNE及 γ-GCS在 COPD氧化/抗氧化失衡发病机制中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料与仪器

6～8周龄雄性W istar大鼠{山西医科大学实验动物中心提供，合格证号 SXCK（晋）2009-0001}30只，平均体重（200±20）g。实验用香烟为湖南中烟工业公司生产的芙蓉牌过滤嘴香烟（烟碱1.0 mg/支，焦油12 mg/支）。大鼠4-HNE和γ-GCS酶联免疫吸附测定试剂盒均购自北京优博奥生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型建立与分组：实验动物分为不吸烟组、吸烟6周组和吸烟12周组，每组10只。分笼饲养于山西医科大学第一医院呼吸科实验室，室温（20±2）℃，湿度40％ ～70％，普通饲料喂养，自由饮水进食。参照文献［4］自制实验性大鼠被动吸烟装置制备模型（自动助燃装置连接密闭玻璃箱）。吸烟组：每次吸烟15支，大约 2 h，每天吸烟2次（上、下午各一次），每周吸烟6 d，各吸烟6周、12周，不吸烟组大鼠正常饲养12周，与吸烟组饲养条件及环境相同。

1.2.2 标本采集：麻醉动物，开腹暴露腹主动脉，取动脉血4 m L，肝素抗凝，离心并留取上清，EP管分装，-70℃冰箱中冻存ELISA备用；左肺用4 m L生理盐水行支气管肺泡灌洗，缓慢地经气道把液体注入肺脏，再缓慢回抽液体，反复推抽4次，重复2次，最终回抽量约 5～6 m L。3 000 r/min离心 10 min后，取上清液，EP管分装，保存于-70℃冰箱ELISA待用。

1.2.3 BALF及外周血中4-HNE含量的测定：采用双抗体夹心酶联免疫吸附（ABC-ELISA）法检测BALF及外周血中4-HNE的表达水平，实验步骤按试剂盒说明书进行，试剂盒灵敏度pg/m L。

1.2.4 BALF及外周血中γ-GCS含量的测定：采用双抗体夹心酶联免疫吸附（ABC-ELISA）法检测BALF及外周血中 γ-GCS的表达水平，实验步骤按试剂盒说明书进行，试剂盒灵敏度U/m L。1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠BALF及外周血4-HNE含量的比较

吸烟6周组和吸烟12周组大鼠BALF及外周血4-HNE含量分别较不吸烟组明显增加，差异具有统计学意义（P均＜0.01），吸烟6周组4-HNE含量较吸烟12周组低（P＜0.01），差异有统计学意义。（表1）

2.2 各组大鼠BALF及外周血γ-GCS含量的比较

吸烟6周组大鼠BALF及外周血γ-GCS含量较之不吸烟组增高，（P＜0.05；P＜0.01），差异有统计学意义；吸烟12周组γ-GCS含量低于不吸烟组（P＜0.05；P＜0.01），差异也有统计学意义（表2）。

2.3 4-HNE含量与γ-GCS含量的相关分析

采用Pearson相关分析，对4-HNE含量及γ-GCS含量的实验数据进行综合分析，吸烟6周组BALF及外周血中二者表达呈正相关（r=0.764，r=0.674）；吸烟12周组BALF中二者表达呈负相关（r= -0.777），而在外周血中二者表达无显著相关性。

3 讨论

正常情况下，肺部产生一定量的氧化物，同时肺部具有抗氧化系统，使氧化物的产生和清除处于平衡状态。吸烟是COPD的主要危险因素，大量的研究证明 ，吸烟者和COPD患者体内的氧化负担加重。4-HNE是脂质过氧化反应醛基产物中最具代表性的物质，生成后能保留在细胞膜中，只有一部分向周围介质中扩散并达到一定浓度，攻击远离原始自由基产生部位的靶目标。在COPD患者中，4-HNE水平的升高在肺部炎症的信号转导中发挥作用，导致炎症介质和保护性抗氧化基因表达的失衡。γ-GCS是谷胱甘肽合成过程中的限速酶，分为重链（γ-GCS-HS）和轻链（γ-GCS-LS）两个亚基，它的数量、活性等直接影响谷胱甘肽的水平。谷胱甘肽是肺部抗氧化的重要屏障，可以保护细胞免受4-HNE的损伤。已知氧化应激可刺激大鼠支气管上皮细胞γ-GCS表达水平增加［3］。4-HNE通过对AP-1介导的信号传导途径的激活对γ-GCS的合成有明显的促进作用。但也有研究表明，与吸烟者相比，γ-GCS在不吸烟者肺泡巨噬细胞中有更高的水平［12］。本研究发现：吸烟6周组大鼠 BALF及外周血4-HNE含量均显著高于不吸烟组；吸烟 6周组大鼠BALF及外周血 γ-GCS含量较之不吸烟组增高，差异均有统计学意义，同时本研究分别对BALF及外周血中4-HNE含量与γ-GCS含量作相关性比较显示吸烟6周组两者的表达呈正相关，因此认为大鼠体液中4-HNE的增加在一定程度上促进了 γ-GCS的增加。有研究发现在小鼠吸入香烟烟雾1 h后，小鼠肺组织切片上与对照组相比可以观察到4-HNE水平升高［6］。吸烟者与非吸烟者相比，在诱导痰中4-HNE含量明显增高。还有学者证实，随着吸烟时间的延长，支气管肺组织中γ-GCS的mRNA及其蛋白表达水平逐渐增高，本实验吸烟6周组与其结论基本相符［4］。有报道研究了23例（包括11例COPD和12例非COPD）现在和以往有相似吸烟年包数的肺切除患者后，证实4-HNE能在肺细胞水平上调γ-GCS的 mRNA［7］。还有研究观察了在生理学相关剂量时4-HNE诱导GSH生物合成的信号传导途径，表明4-HNE通过JNK信号途径诱导谷胱甘肽的生物合成，并指出了由AP-1驱动在人支气管上皮细胞γ-GCS两个亚基的基因表达中所起的巨大作用［8，9］。上述研究均提示了4-HNE在一定程度上可以诱导γ-GCS的产生，但本实验中导致该结果的确切机制尚不清楚。

表1 4-HNE含量（pg/m L）表达（n=10，±s）Tab.1 The expression of 4-HNE in BALF and peripheral blood of the rats

表1 4-HNE含量（pg/m L）表达（n=10，±s）Tab.1 The expression of 4-HNE in BALF and peripheral blood of the rats

注：△与不吸烟组比较P＜0.01；▲与吸烟6周组比较，P＜0.01△Compared with the non-smoking group，P＜0.01；▲Compared with the 6-weeks smoking group，P＜0.01

组别Groups 肺泡灌洗液BALF 外周血Peripheral blood不吸烟组Non-smoking 15.917±1.584 12.305±1.822吸烟6周组6-weeks smoking 21.376±2.80△ 18.333±2.585△吸烟12周组12-weeks smoking 28.634±2.999▲ 22.754±3.882▲

表2 γ-GCS含量（U/mL）表达（n=10，±s）Tab.2 The expression ofγ-GCS in BALF and peripheral blood of the rats

表2 γ-GCS含量（U/mL）表达（n=10，±s）Tab.2 The expression ofγ-GCS in BALF and peripheral blood of the rats

注：△与不吸烟组比较，P＜0.05；▲与不吸烟组比较，P＜0.01；●与吸烟六周组比较，P＜0.01Note：△Compared with the non-smoking group，P＜0.05；▲Compared with the non-smoking group，P＜0.01；● Compared with the 6-weeks smoking group，P＜0.01

组别Groups 肺泡灌洗液BALF 外周血Peripheral blood不吸烟组Non-smoking 13.525±2.311 11.847±1.171吸烟6周组6-weeks smoking 15.802±1.647△ 16.221±1.577▲吸烟12周组12-weeks smoking 11.527±1.606△● 9.015±1.569▲●

本研究还发现：吸烟12周组大鼠BALF及外周血4-HNE含量高于吸烟6周组，而吸烟12周组γ-GCS含量低于不吸烟组，差异均有统计学意义。相关性分析显示吸烟12周组外周血中4-HNE与 γ-GCS表达无相关性，而在 BALF中二者表达呈负相关，提示随着4-HNE的大幅增加，γ-GCS逐渐呈下降趋势，谷胱甘肽逐渐耗竭，长期香烟烟雾暴露引起了肺部氧化/抗氧化失衡，在最终导致COPD的发生发展过程中发挥着重要作用。有研究［8］发现：谷胱甘肽浓度在10μmol/L 4-HNE刺激后12 h达到最高水平，24 h后谷胱甘肽的水平开始降低，当细胞内谷胱甘肽被消耗时，细胞对4-HNE的毒性作用变得敏感。Harju等［10］通过免疫组织化学的方法对22位患有慢性阻塞性肺疾病（COPD）的患者，20位吸烟没有患COPD者及13位终身未吸烟者进行研究，通过免疫电镜方法评定，证实 γ-GCS重链和轻链两个亚单位大部分显著地表达在大气道，与所有吸烟者相比不吸烟者中央支气管上皮细胞γ-GCS-HS的表达显示更高的趋势，与吸烟者相比 γ-GCS-HS和γ-GCS-LS在不吸烟者肺泡巨噬细胞有更高的水平。此研究还表明γ-GCS在吸烟者肺部气道内的免疫活性降低。另有研究也证实了该结论，该研究还发现γ-GCS在不吸烟非慢性支气管炎者表达最强，而在吸烟者与慢性支气管炎者的气道内表达下调。本实验对大鼠体液中的γ-GCS进行测定，吸烟12周组结果与在人中央支气管上皮细胞和肺泡巨噬细胞中的变化基本一致［11］。已证实在生理条件下谷胱甘肽可以直接通过谷胱甘肽-S-转移酶与4-HNE反应形成复合物排出细胞，在4-HNE导致谷胱甘肽逐渐消耗中发挥作用，而在具体不同的细胞系中，该代谢途径仍报道不一［12］。至于该解毒机制是否导致了本实验中γ-GCS的逐渐降低，尚需后续的实验来证实。

氧化/抗氧化失衡是COPD的重要发病机制，近年来人们对4-HNE的认识已逐渐深入，长期接触香烟烟雾会导致肺内氧化产物的大量蓄积和抗氧化剂的不断消耗，4-HNE的不断增加与抗氧化酶 γ-GCS的逐渐消耗可能在COPD的发生发展过程中发挥重要作用，在未来的发展中，进一步深入探索二者表达的失衡与吸烟所致COPD的关系，有助于发现新的治疗方法用以预防或治疗慢性阻塞性肺疾病。

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