鸡胆粉HPLC指纹特征研究

邹纯才，鄢海燕

(皖南医学院1.药物分析与药物化学教研室;2.药剂学与生药学教研室，安徽芜湖241002)

鸡胆为雉科动物鸡Gallus gallus domosticus Brisson的干燥胆，味苦性寒，无毒，有清热解毒、泻肺火、理肺气之功效，其含有较高的鹅去氧胆酸、牛磺酸和胆酸等成分[1]。虽有文献报道用高效液相色谱法测定鸡胆粉中胆酸类成分的含量[2]，用毛细管电泳法对鸡胆汁进行鉴别等[3]，但未见有关鸡胆汁化学指纹图谱的相关报道，也未见有关土鸡胆粉与肉鸡胆粉的化学成分及其含量异同的相关研究报道。考虑紫外检测器的普及性，特别是DAD检测器所能提供的紫外信息，为更好地全面反映鸡胆粉的质量，本文采用HPLC-DAD法对10批鸡胆粉进行分析，建立以鹅去氧胆酸为参照物的鸡胆粉的指纹特征图谱的分析方法。该法简便、准确、重现性好，为鸡胆粉的质量控制及熊胆粉相关代用品的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂岛津LC-20A高效液相色谱仪(含LC-20A真空在线脱气机，LC-20AT四元泵，CTO-10AS柱温箱，SPD-M20A检测器)，对照品胆酸、鹅去氧胆酸和猪去氧胆酸、熊去氧胆酸(中国药品生物制品检定所，批号分别为:0078-9312、110806-200704、087-9406、0755-9003)，乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。鸡胆购自芜湖市月河星城菜市场和氵鲁港菜市场，经皖南医学院药剂与生药学教研室包淑云博士鉴定为雉科动物鸡的胆。

1.2 溶液制备

1.2.1 对照品溶液分别精密称取经五氧化二磷减干燥12 h的胆酸、鹅去氧胆酸和猪去氧胆酸、熊去氧胆酸对照品适量，加乙醇制得含胆酸、鹅去氧胆酸和猪去氧胆酸、熊去氧胆酸约0.5 mg/ml的对照品溶液。

1.2.2 供试品溶液的制备将新购置的鸡胆过滤，于真空干燥箱中干燥，至恒重。取细粉约0.1 g，精密称定，加10%NaOH溶液5 ml，水浴加热8 h，滴加盐酸调节pH值至2～3，摇匀。用乙酸乙酯振摇提取4次，每次10 ml，合并提取液，蒸干，残渣加乙醇使溶解，转移至10 ml量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，经0.22 μm滤膜过滤即得。

1.3 色谱条件色谱柱:Lichrospher C18(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相:乙腈-0.001 mol/L KH2PO4溶液，梯度洗脱(0～20 min，乙腈30%→30%;20～40 min，乙腈30%→40%;40～70 min，乙腈40%→50%);流速:1.0 ml/min;柱温30℃;DAD检测器，检测波长为210 nm，进样量:10 μl。计算程序:《中药数字化色谱指纹谱相似度评价软件》[4－5]。

1.4 色谱特征峰标定取标准品溶液及供试品溶液按选定色谱条件测定，记录其色谱图，按规定方法积分。见图1、2。通过保留时间和标样添加法确定:在图1中第11号峰为胆酸峰，第15号峰为鹅去氧胆酸峰，并选定其为鸡胆粉指纹图谱的参照峰。

图1 标准品色谱图Fig 1HPLC fingerprint chromatography of standard substances

1.5 方法学考察

1.5.1 精密度试验取同一供试品溶液连续进样6次，依法测定，18个吸收峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD均＜3%，表明仪器精密度良好。

图2 鸡胆粉色谱图Fig 2HPLC fingerprint chromatography for chicken bile powder

1.5.2 重复性试验精密称取同一供试品5份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别依法测定，18个吸收峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD均＜3%，表明重复性良好。1.5.3稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0、12 h、24 h、36 h、48 h进样，18个吸收峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD均＜3%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2 结果

2.1 鸡胆粉的指纹特征以1号样品为基准样品，共有峰窗口为0.02，n强峰数为8，共有率要求≥80%，n强峰出现频次≥8，进行数据处理，得鸡胆粉的指纹图谱库。采用综合信息指数法[6，7]计算指纹图谱间的相似度。结果见图3、表1、2。

表1 鸡胆粉的特征指纹图谱库Tab 1 Characteristic fingerprint database of chicken bile powder

表2 10批鸡胆粉的相似度表Tab 2 Similarities of 10 batches of chicken bile powder

2.2 特征峰的聚类采集鸡胆粉指纹图谱18个特征峰的数据，分别以欧氏距离和夹角余弦对10批鸡胆粉进行系统聚类，绘制系统聚类树图，相关系数分别为0.9031和0.9561，结果见图4。由图4的分析可知，采用欧氏距离法由特征峰的信息可将土鸡胆粉与肉鸡胆粉划分为明显的两类。

3 讨论

3.1 鸡胆中所含的胆汁酸类成分只在200 nm左右吸收较强，灵敏度较高。但由于该吸收为末端吸收，因此选择200 nm左右的波长作为测定波长很容易导致基线漂移，特别是以甲醇为流动相时。为此本文采用了乙腈和水组成的流动相，并选择210 nm作为测定波长有效地降低了基线漂移;另外还要保证测定过程中波长的准确和仪器的稳定以克服末端吸收即测定波长在吸收曲线的陡坡处时所带来的测定结果的不稳定。

3.2 鸡胆粉的样品处理参照《中国药典》2010年版一部猪胆粉的含量测定项下样品的处理方法，但对水解温度和时间做了调整，即98℃～100℃水浴8 h可保证水解完全。

3.3 色谱条件选择试验中，比较了甲醇作为有机相及不同缓冲溶液的流动相，也比较了不同流速及不同的梯度方式，结果以所选定的色谱条件为最佳，特别是流动相中缓冲溶液的量及pH值对图谱的影响非常大，控制不当则得不到相应的图谱。

图3 10批鸡胆粉的HPLC指纹图谱Fig 3HPLC fingerprint chromatography for 10 batches of chicken bile powder

图4 特征峰数据的层次聚类树图Fig 4 Dendrogram of hierarchical clustering from data of characteristic peaks

3.4 建立了鸡胆粉的特征指纹图谱库。10批鸡胆粉的特征指纹图谱库的相似度阈值为0.899，特征峰为18个，10批药材检出峰数均为18个，检出峰率为100%，重叠峰数为18个;重叠峰数为100%。说明所研究的土鸡胆粉与肉鸡胆粉的色谱指纹特征非常相近，但特征成分间含量有一定差异。

3.5 通过相似度可知，1～5号样品较为接近，6～10样品相似度较为接近，通过聚类分析也验证了这一点。比较了夹角余弦法和欧氏距离法，以欧氏距离法分类效果较好。在欧氏距离法中1～5号(肉鸡胆粉)聚为一类，6～10号(土鸡胆粉)聚为一类。说明肉鸡胆粉与土鸡胆粉成分含量略有不同。土鸡胆粉间相似度波动较大，说明存在个体差异，可能与生存环境和饲养条件不同有关;而肉鸡胆粉间相似度波动较小，说明个体差异较小，与其生存环境和饲养条件基本相近有关。

[1]张青.鸡胆汁的药理作用及应用[J].食品与药品，2005，7(2A):18－19.

[2]王冠，许敏，周华峰，等.RP-HPLC法测定蛇胆、鸡胆、猪胆的胆汁酸成分及其抑菌作用的研究[J].现代科学仪器，2008(3):52－55.

[3]刘萍，古今，冯建涌.熊胆与猴胆、鸡胆汁的高效毛细管电泳法鉴别[J].中国药物应用与监测，2005(4):17－20.

[4]邹纯才，鄢海燕，方洪壮.决明子指纹图谱数据库的实现与应用[J].计算机与应用化学，2008，25(4):494－498.

[5]邹纯才，鄢海燕.中药数字化色谱指纹谱相似度评价系统:中国，200710190089.2[P].

[6]孟庆华，刘永锁，王键松，等.色谱指纹图谱相似度的新算法及其应用[J].中成药，2003，25(1):4－8.

[7]邹纯才，鄢海燕.中药指纹图谱及其数字化[M].合肥:安徽科学技术出版社，2008:162.