半支莲主要化学成分的HPLC-TOF/MS分析

纪松岗，刘 悦，毛 飞，李 祥，柴逸峰(.解放军第40医院药剂科，山东青岛6607;.第二军医大学药学院，上海004;.北京儿童医院药剂科，北京00056)

半枝莲为唇形科黄芩属植物半枝莲Scutellaria barbata D.Don的干燥全草，是我国传统的中药，其名最早见于《外科正宗》，主要产于浙江、江苏、安徽、河南、四川、广东、福建、陕西等省［1］。其味辛、苦，性寒，具有清热解毒、化瘀利尿、活血祛疲、消肿止痛之功效，用于治疗疮痈肿毒、蛇虫咬伤、痢疾、肝炎及肝硬化等症。现代药理研究表明，半枝莲的水提物与醇提物均有明显的抗肿瘤活性［2，3］，常用于肝癌、肺癌及胃癌等癌症的防治［4］。

中外学者研究发现半枝莲的主要化学成分为生物碱、黄酮类、多糖、有机酸、甾醇等［5］。目前对半枝莲中化学成分分析主要是采用传统的植物化学的方法进行分离提取［6，7］，部分研究采用高效液相色谱法进行分析［8］，这些方法一般分析时间较长，而且仅针对其中某几种或某一类物质进行分析，而缺乏从整体上系统地阐述半枝莲的复杂化学成分。

本研究采用HPLC-TOF/MS技术对半枝莲中多成分进行了鉴别，该法操作简便、快速、准确，对阐明半枝莲药效物质基础、质量控制、开发现代中药新药等具有重要意义。

1 仪器和试药

1.1 仪器 Agilent 1200系列快速液相色谱仪，配有在线脱气机、二元泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器;Agilent 6220高分辨飞行时间质谱仪，配有标准电喷雾离子源(ESI)，分析软件为MassHunter在线工作站和Qualiative Analysis离线分析软件DJ-04药材粉碎机(上海淀久公司);Mettler AE240型十万分之一电子天平;Kudos-SK2200H超声发生器(上海科导超声仪器公司)。

1.2 试药 半枝莲草药材由第二军医大学药学院生药学教研室孙连娜副教授鉴定为唇形科黄芩属植物半枝莲Scutellaria barbata D.Don。HPLC级乙腈(Merck，Germany);HPLC级甲酸(Tedia，USA);无水乙醇为分析醇(中国医药集团上海化学试剂公司);水为娃哈哈纯净水。

2 试验

2.1 色谱及质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱:SHISEIDO CAPCELL PAK C18(100 mm×3.0 mm，3 μm)，流动相A相为乙腈，B相为水(含0.1%甲酸)，梯度洗脱，A相比例随时间的变化:25%(1～5 min);25%～55%(5～12 min);进样量:3 μl;流速:0.6 ml/min;柱温25℃;运行时间30 min;柱后分流比为3∶1。

2.1.2 质谱条件 采用ESI源，正离子模式，雾化气为高纯氮气。具体质谱参数:毛细管电压4 000 V，干燥气温度350℃，干燥气流速9 L/min，雾化气压力35 psi(1 psi=6 894.8 Pa)，碎片电压180 V;参比离子m/z 121.050 8和m/z 922.009 7;质量数扫描范围m/z 100～1 000测定样品之前，使用调谐液校准质量轴，以保证质量精度误差小于1×10－6。

2.2 供试品溶液制备 取半枝莲药材适量，粉碎后过40目筛，称取半支莲药材1.0 g，置100 ml量瓶中，加70%乙醇20 ml，称重，超声30 min(超声功率为500 W，频率40 kHz)，冷却后补足失重。取5 ml醇提液，10 800 r/min离心5 min，取上清，再用微孔滤膜过滤(0.45 μm)过滤，作为供试品溶液。在“2.1”项色谱条件下进样分析。

2.3 半枝莲化学成分数据库的建立 根据国外专业数据库Pubmed Chem Spider、中国科学院化学专业数据库等及国内外相关研究文献，收集了半枝莲各种化学成分名称及分子式共87个，采用安捷伦formula-database generator软件(含各元素精确质量数)，计算精确相对分子质量，建立了包括化合物名称、分子式、精确相对分子质量M+H准分子离子峰相对分子质量的相应的化学成分数据库。

3 结果与讨论

3.1 提取溶剂的选择 首先考察了提取方法，本试验选择了较为简便的溶剂超声法。对于提取溶剂，由于半枝莲主要成分为黄酮类，根据其成分特点，考察了甲醇以及70%乙醇，发现采用70%的乙醇提取获得的峰容量最大，故采用70%乙醇超声为提取方法。

3.2 实验条件优化 考察了甲醇-水、乙腈-水系统，发现乙腈的洗脱效果优于甲醇，且各色谱峰分离效果更好，加入0.1%甲酸可以改善峰拖尾，并提高质谱响应，故采用乙腈-水(0.1%甲酸)为流动相。质谱检测比较了正、负离子两种扫描模式，结果发现正模式下峰容量大，质谱响应更好，故实验最终选择在正模式下进行。

3.3 半枝莲中主要化学成分的鉴别 在优化的色谱质谱条件下，半枝莲提取液的HPLC-TOF/MS典型总离子流图见图1。我们对其中主要的15个峰进行了鉴别，其中包括4对同分异构体。其中，峰2和4这一对同分异构体，两者质谱裂解所得碎片离子相同，故通过对比标准物质的保留时间和质谱图，判定峰2为红花素葡萄糖醛酸苷，峰4为异红花素葡萄糖醛酸苷。其它化合物按照以下方法鉴别:首先，根据TOF-MS上所得到的精确化合物分子量信息，通过Mass Hunter软件在5 ppm的质量偏差范围内计算其可能的元素组成，并将其与所建的数据库相匹配，对半枝莲化学成分的初步鉴别，结果见表1。然后对同分异构体进行鉴别，调节碎片电压至360 V，获得化合物结构相关的碎片离子，根据离子的裂解情况，结合数据库中各化合物的化学结构，区分各同分异构体，结果见表2。最终确证了其中的15个峰，结果见表1。

图1 半枝莲提取物TOF/MS总离子流图

以分子离子峰287为例，来说明鉴别过程。在碎片电压160 V条件下，峰9和峰10的分子离子峰均为287。首先确定峰9和峰10精确的分子离子峰分别为287.055 8与287.056 0，可推断峰9和峰10的元素组成均为C15H10O6，通过与数据库匹配，初步可判定其为一对同分异构体，Scutellarein和Luteolin。为进一步区分这对同分异构体，调节碎片电压至360 V，得到此电压条件下的质谱图。峰9的质谱图上有明显的169.013 7［M+H-C8H6O］+，123.008 2［M +H-C8H6O-CO-H2O］+，119.049 7［M+H-C7H4O5］+等碎片离子信息，推断出裂解途径见图2(a)所示。峰10的质谱图上有明显的153.018 8［M+HC8H6O2］+，135.044 6［M+H-C7H4O4］+，161.023 9［M+H-C6H6O3］+等碎片信息，推断出裂解途径见图2(b)所示。结合以上信息，我们能够鉴定峰9为Scutellarein，峰10为Luteolin。采用类似的方法，能够对其他峰也进行相应的鉴别。

表2 半枝莲成分中的同分异构体鉴别结果

图2 Scutellarein和Luteolin ESI+MS裂解途径

综上所述，本实验采用HPLC-TOF/MS技术，结合数据库匹配，实现了对半支莲中主要成分的快速定性分析，共鉴定出15个半支莲中的主要糖苷类和黄酮类成分。该方法快速、灵敏、准确度高，可作为半支莲质量控制的方法之一，同时为半支莲的药理学和临床药学研究提供了化学物质基础信息。

［1］ 王桂玲，房建强，赵雪梅，等.半枝莲中总生物碱的提取和纯化条件研究［J］.中国现代应用药学，2011，28(5):399.

［2］ Lee TK，Kim DI，Song YL，et al.Differential inhibition of Scutellaria barbata D.Don(Lamiaceae)on HCG-promoted proliferation of cultured uterine leiomyomal and myometrial smooth muscle cells［J］.Immunopharmacology and immunotoxicology，2004，26(3):329.

［3］ 陶 伟.中药半枝莲的药理及临床应用研究进展［J］.海军医学杂志，2008，29(2):181.

［4］ 邹箴蕾，吴启南.半枝莲的化学成分及药理作用研究进展［J］.时珍国医国药，2005，16(2):149.

［5］ 仲 浩，薛晓霞，姚庆强.半枝莲化学成分的研究［J］.中草药，2008，39(1):21.

［6］ 李 萍，左甜甜，王晓秋，等.半枝莲的化学成分研究(Ⅱ)［J］.中国药物化学杂志，2008，18(5):374.

［7］ 何枢衡，祎 张，葛丹丹，等.中药半枝莲黄酮类成分的分离与结构鉴定［J］.沈阳药科大学学报，2011，28(3):182.

［8］ 涂琪顺，蔡光明，何 群，等.HPLC法测定半枝莲中二萜类生物碱scutebarbatine B［J］.中草药，2008，39(2):280.