原发性胆汁性肝硬化患者特异性自身抗体的实验研究

1 资料与方法

1.1 临床资料 48例PBC及182例非PBC患者均为南昌大学第二附属医院及第一附属医院2008年1月～2011年6月门诊、住院确诊病例，诊断标准参照2009年美国肝病学会(AASLD)关于PBC诊断建议［1］。其中182例非PBC患者分别为AIH 29例，原发性硬化性胆管炎(PSC)11例，病毒性肝炎患者72例，其中乙型肝炎(HB)51例、丙型肝炎(HC)21例;结缔组织病患者70例，其中系统性红斑狼疮(SLE) 28例、干燥综合征(SS)20例、类风湿关节炎(RA)22例。对照组50例，均为健康体检者。

1.2 试剂与方法

1.2.1 标本的采集所采的被检标本均为空腹不抗凝血2～3 mL，以2 500 r/min速度离心15 min分离血清，－20℃冷冻待检。

1.2.2 检测方法检测ANA、抗双链DNA抗体(ds-DNA)、AMA、抗平滑肌抗体(SMA)及抗细胞质抗体(ACYA)采用欧蒙医学实验诊断有限公司生产的免疫荧光试剂，应用间接免疫荧光法检测。检测方法为检查加样板，生物载片恢复至室温，稀释血清，设阴、阳性对照、质控对照，加25 μL稀释后血清，至加样板的每一反应区。再将生物薄片盖于加样板的凹槽里，室温孵育30 min，冲洗，加荧光素20 μL。室温孵育30 min，再冲洗，封片镜检。检测抗线粒体抗体 M2亚型(AMA-M2)、抗 GP210和抗SP100抗体采用欧蒙医学实验诊断有限公司生产的免疫印迹试剂，严格按操作说明书进行操作。

1.3 统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，两组计数资料用χ2检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料共纳入48例PBC患者，其中男6例、女42例，男女比例为1∶7;确诊时年龄26～71岁、平均45.6岁。患者均无特殊临床表现。因肝功能异常就诊，确诊时间为0.5～22个月、平均8.1个月;29例AIH和11例PSC患者中男5例、女35例，男女比例为1∶7，确诊时年龄4～67岁、平均44岁; 72例病毒性肝炎患者中男30例、女42例，男女比例为1∶1.4，确诊时年龄17～57岁、平均38岁;70例结缔组织病患者中男7例、女63例，男女比例为1:10，确诊时年龄11～65岁、平均37岁;50例对照组中男20例、女30例，年龄23～47岁、平均33岁。

2.2 间接免疫荧光法检测结果见表1。

表1 间接免疫荧光法检测抗体结果［例(%)］

2.3 免疫印迹法检测结果见表2。

表2 免疫印迹法检测抗体结果［例(%)］

2.4 临床评价指标结果见表3。

3 讨论

PBC是一种非临床常见病，我国尚无PBC完整的流行病学资料，随着对疾病认识和检验水平的提高，PBC发病率也逐年升高。PBC一般在50岁左右发病，多见于中年女性，男女之比约为1∶8［2，3］。本研究病例数男女之比为1∶7，平均年龄45.6岁。PBC的确切病因和发病机制尚不清楚，研究发现，PBC发病与病原微生物感染、自身免疫、接触化学物品、遗传和环境因素等有关［4］，这与自身免疫病的发病机制极为相近。本组病例存在ANA、AMA及GP210等多种与自身免疫病相关的自身抗体，这不仅表明免疫机制参与了PBC的发生，同时亦对PBC诊断提供了有力的实验室依据。PBC患者常伴有ANA的升高，其阳性率各不相同，甚至在AMA阴性患者中更常见，阳性率仅次于AMA。分析Hep-2细胞上的ANA荧光核型发现，ANA阳性PBC患者的荧光核型表现具有特殊性，分别为细胞质型、核膜型、核多点型和着丝点型。本研究48例PBC患者中的ANA阳性20例，阳性率为41.7%。ANA的检出率与PBC患者AMA的滴度明显相关，其AMA和AMA-M2抗体水平越高，ANA的检出率越高。目前，AMA阴性PBC的病例逐渐增加，其诊断主要依靠临床表现和肝脏组织学诊断，缺乏特异性的指标，诊断较困难。因此，这些患者其血清非器官特异性的自身抗体检测尤其重要。

表3 PBC等患者抗体检测的各项实验评价指标结果

AMA是一种以线粒体为靶抗原，无种属和器官特异性的自身抗体，该抗体能在PBC患者血清中检出。线粒体存在于多种组织细胞，线粒体抗原位于线粒体内外膜，AMA作为一种自身抗体可进入细胞，直接与线粒体抗原作用，导致组织细胞的损伤。PBC与自身免疫反应密切相关，但其发生机制仍不完全明了，Subasic'等［5］认为病毒可能参与激活自身免疫性疾病及自身抗体的产生。我们检测48例PBC，AMA阳性45例，阳性率达93.8%，而非PBC阳性率只有19.2%，两组比较差异有统计学意义，与文献报道基本一致［2］。目前为止，发现AMA膜上存在9种自身抗原(M1～9)，与PBC关系最大的是M2，M2伴M4、M8阳性多见于PBC［6］。AMA是PBC的血清学标志，其中AMA-M2对PBC有高度的敏感性和特异性。血清抗AMA-M2抗体诊断PBC的特异性比较高，为本病突出的免疫学指标异常，也是最重要的诊断手段。本研究检测结果阳性33例，阳性率为68.8%，与非PBC比较，差异均有统计学意义，同Milkiewicz等［6］结果基本一致。

抗GP210抗体的靶抗原是位于核孔复合物上的210 kD跨膜糖蛋白，所识别的表位是GP210羧基末端上的15个氨基酸残基，故名为GP210。其抗原决定簇为氨基末端的15个线样氨基酸片段和羧基末端的氨基酸片段。抗GP210抗体对PBC诊断的敏感性不高，只有41.7%，但特异性则高达97.4%，尤其是在AMA阴性的PBC患者中有非常强的诊断价值，这和Nakamura等的结果基本一致。

SP100蛋白是1个磷酸化的细胞核蛋白，电泳时其分子量为100 kD。SP100是一转录活化因子，用SV40和JC病毒转化细胞，或者用有丝分裂原刺激淋巴细胞，以及用干扰素处理细胞都可观察到SP100蛋白水平和mRNA水平的升高［4］。SP100为核多点型靶抗原之一，是通过负向调节内皮素1的作用来实现其生物学作用的。本研究对48例PBC患者检测抗SP100抗体阳性8例，阳性率为16.7%，其AIH、PSC和HB等及对照组均不敏感。

总之，应用免疫荧光法和免疫印迹法对PBC患者检测AMA、AMA-M2、抗GP210和SP100等多种自身抗体，在临床上对PBC具有广阔应用前景，将会对PBC患者的诊断、鉴别诊断、治疗及预后具有重要的作用，可提高PBC诊疗水平。

［1］Lindor KD，Gershwin ME，Poupon R，et al.Primary biliary cirrhosis［J］.Hepatology，2009，50(1):291-308.

［2］Cavazzana I，Ceribelli A，Taraborelli M，et al.Primary biliary cirrhosis-related autoantibodies in a large cohort of italian patients with systemic sclerosis［J］.J Rheumatol，2011，38(10):2180-2185.

［3］Sfakianaki O，Koulentaki M，Tzardi M，et al.Peri-nuclear antibodies correlate with survival in Greek primary biliary cirrhosis patients［J］.World J Gastroenterol，2010，16(39):4938-4943.

［4］Norman GL，Bialek A，Encabo S，et al.Is prevalence of PBC underestimated in patients with systemic sclerosis［J］.Dig Liver Dis，2009，41(10):762-764.

［5］Subasi'c D，Karamehi'c J，Ljuca F，et al.Correlation of autoantibodies presence detected by IFA-anti-dsDNA，IFA-AMA and immunoblotting with corresponding data in clinical management of autoimmune diseases［J］.Bosn J Basic Med Sci，2008，8(1):86-92.

［6］Milkiewicz P，Buwaneswaran H，Coltescu C，et al.Value of autoantibody analysis in the differential diagnosis of chronic cholestatic liver disease［J］.Clin Gastroenterol Hepatol，2009，7(12): 1355-1360.