5种地锦药材中总黄酮及3个酚酸类成分测定研究

李 慧， 许 亮， 徐保利， 管慧洁， 何 华， 王 冰

(辽宁中医药大学，辽宁大连116600)

地锦草为大戟科植物地锦Euphorbia humifusa Willd．或斑地锦 Euphorbia maculata L．的干燥全草。具有清热解毒、凉血止血、利湿退黄的功效。常用于治疗痢疾、肠炎、咳血、便血、崩漏、疮疥痈肿，湿热黄疸等［1］。药理研究表明地锦草的抗菌抗炎作用明显，止血作用效果好，有很强的清除和抑制自由基的作用，是一种较强的抗氧化植物，而且对·OH引发的DNA氧化损伤有一定的保护作用［2］。

通奶草，千根草和大地锦是同科属植物通奶草Euphorbia hypericifolia Linn．，千根草Euphorbia thymifolia Linn．和大地锦 Euphorbia nutans Lagasca．的干燥全草。据文献报道通奶草全草入药，微酸、涩，微凉，通奶故得名［3］。千根草全草入药，有清热利湿、收敛止痒的作用，主治菌痢、肠炎、腹泻等［3］。

地锦草主要含有黄酮类、酚酸类化学成分，其鲜汁、水煎剂、醇提液均有抗菌作用。其中黄酮类化合物是地锦草抗菌、止血、抗氧化的主要有效成分。没食子酸具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等生物学活性;槲皮素、山柰素等黄酮类化合物是地锦草抗菌、止血、抗氧化的主要有效成分。黄酮类及酚酸类的含有量高低影响着药材的疗效。为了了解地锦草及其3种同科属植物中总黄酮及此3种指标性成分的含有量区别，本实验对5个不同种的地锦类药材进行总黄酮和3个酚酸类化合物的定量测定并对其进行数据分析，为地锦类药材的质量评价和开发药材资源、鉴定药用植物真伪奠定了基础。

1 仪器与试药

1.1 药物

药材均为采集样品，经辽宁中医药大学药用植物教研室王冰教授鉴定为地锦Euphorbia humifusa Willd．，斑地锦 Euphorbia maculata Linn．，通奶草Euphorbia hypericifolia Linn．，大地锦 Euphorbia nutans Lagasca．和千根草 Euphorbia thymifolia Linn．的干燥全草。

1.2 仪器与试剂

UV3010紫外分光光度计 (日本日立公司)，Agilent 1100高效液相色谱仪、VWD检测器(G1314A)、四元泵 (G1311A)(美国Agilent公司)，电子天平 (瑞士 Mettler Toledo AG285、AE240)，KQ3200B型超声波清洗仪 (昆山超声仪器有限公司)。

没食子酸、槲皮素、山柰素、芦丁对照品 (贵州迪大生物技术公司，纯度≥98%)。石油醚、甲醇、乙醇 (科密欧试剂有限公司)，重蒸馏水，盐酸、磷酸。除色谱甲醇实验所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 5种地锦药材总黄酮的测定

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品28.0 mg，置50 mL量瓶中，加60%乙醇至刻度，混匀，作为对照品溶液 (芦丁质量浓度为0.56 mg/mL)。

2.1.2 供试品溶液的制备 取样品粉末 (过60目筛)2 g，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚(60～90℃)回流脱至无色，弃去醚液，药渣挥至无醚味，加20倍60%乙醇称定质量，超声提取，每次1.5 h提取3次，每次提取后称定质量，用60%乙醇补足损失的质量，混匀，过滤，合并滤液，蒸干，用60%乙醇溶解，转移至100 mL量瓶中，加60%乙醇至刻度。

2.1.3 标准曲线绘制 分别移取上述配制好的芦丁对照液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL于7只规格相同的25 mL量瓶中，加60%乙醇至6.0 mL，依次加入5%亚硝酸钠试液1.0 mL，放置6 min，10%硝酸铝试液1.0 mL，放置6 min，10%氢氧化钠试液10.0 mL，加60%乙醇至刻度，混匀，放置15 min后，以相应试剂做空白，于510 nm处测定吸光度，以对照品质量浓度 (C)与吸光度(A)进行直线回归，得回归方程:Y=4.980 1X+0.003 8(r=0.999 9)，在0.022 4～0.134 4 mg/mL内呈良好的线性。

2.1.4 最大吸收波长及稳定性考察 精密量取芦丁对照品液和样品液各12.5 mL分别置于25 mL量瓶中，依次加入5%亚硝酸钠试液1.0 mL，放置6 min，10%硝酸铝试液1.0 mL，放置6 min，10%氢氧化钠试液10.0 mL，加60%乙醇至刻度，混匀，放置15 min后，以相应试剂做空白，于UV3010紫外分光光度计上进行全波长扫描，最大吸收波长为510 nm，同时在510 nm波长处进行时间扫描，平均吸光度为0.2754和0.3356，RSD为0.25%和0.28%显示150 min内基本稳定。

2.1.5 精密度实验 精密吸取对照品溶液5 mL，置于25 mL量瓶中，依次加入5%亚硝酸钠试液1.0 mL，放置6 min，加10%硝酸铝试液1.0 mL，放置6 min，加10%氢氧化钠试液10.0 mL，加60%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min后，以相应试剂做空白，在510 nm处测定吸光度7次，计算供试品溶液中总黄酮。平均吸光度为0.2756，RSD为0.25%。显示实验精密度良好。

2.1.6 重复性实验 按2.1.2项方法制备供试品溶液，按2.1.3项方法显色，平行做7份。于510 nm处测定其吸光度，并计算其总黄酮。其平均质量分数为6.66 mg/g，RSD为0.28%。重复性良好。

2.1.7 加样回收率 取6号粉末 (过60目筛)7份，每份精重称定2 g，分别添加9.20 mg芦丁对照品，按2.1.2项下供试品溶液制备方法制备并按2.1.3项显色并测定。平均加样回收率为100.52%，RSD为0.33%。

2.1.8 样品测定 按2.1.2项方法制备供试品溶液，按2.1.3项方法显色。于510 nm处测定其吸光度，并计算其总黄酮含有量。

2.2 5种地锦类植物中没食子酸、槲皮素及山柰素的测定

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取没食子酸、槲皮素和山柰素对照品，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为0.518 mg/mL、0.702 mg/mL、0.408 mg/mL的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 称取各编号粉末 (过60目筛)3.0 g，精密称定，置250 mL圆底烧瓶中，精密加入80%甲醇100 mL，称定质量，加热回流1.5 h，放冷，称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，混匀，滤过，精密量取续滤液40 mL，精密加入25%盐酸溶液14 mL，置85℃水浴中水解30 min，取出，迅速冷却，转移至100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 色谱条件 Agilent TC-C18色谱柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为甲醇－0.4%磷酸水系统，使用前超声脱气30 min，采用梯度洗脱，0～13 min，2%甲醇，13～14 min，52%甲醇，14～30 min，52%甲醇;体积流量1 mL/min;柱温30℃，检测波长0～12.5 min，270 nm，12.5～30 min，360 nm。

2.2.4 方法专属性 将没食子酸、槲皮素和山柰素对照品混合溶液和制备的供试品溶液分别进样10 μL分析，见图1。可见没食子酸、槲皮素和山柰素峰达到基线分离，无杂质干扰。理论塔板数按槲皮素、山柰素和没食子酸计算均不低于20 000。

2.2.5 线性关系考察 精密吸取上述对照品溶液，在选择的色谱条件下分别进样，没食子酸Y=2 830.3X+2.357 1，r=0.999 8(n=6)，线性范围0.051 8～0.621 6 μg;槲皮素 Y=2 997.3X－22.906，r=0.999 8(n=6)，线性范围0.070 2～0.702 0 μg;山柰素 Y=3 260.8X －27.26，r=0.999 9(n=6)，线性范围0.020 4 ～0.408 0 μg。

2.2.6 精密度试验 吸取对照品溶液5 μL，连续进样6次，记录峰面积，结果没食子酸、槲皮素和山柰素峰面积的RSD分别为1.96%、2.09%、2.84%。

图1 对照品 (A)和样品 (B)色谱图Fig.1 HPLC Chromatograms of reference substances(A)and the sample(B)

2.2.7 稳定性考察 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、12 h进样，记录峰面积，结果没食子酸、槲皮素和山柰素峰面积的RSD分别为1.96% 、2.86%、1.41%。表明供试品溶液在0～12 h内稳定性良好。

2.2.7 重复性试验 取同批药材6份，精密称定，按2.2.2项下供试品溶液制备方法制备并测定，RSD分别为2.17%、2.85%、1.50%。

2.2.8 加样回收率试验 取5号地锦草粉末6份，每份约3.0 g，精密称定，分别添加没食子酸、槲皮素、山柰素对照品2.590 mg、3.510 mg、2.040 mg，按2.2.2项下供试品溶液制备方法制备并测定，计算。没食子酸、槲皮素、山柰素的平均回收率 (RSD)分别为102.17%(2.83%)、97.80%(2.42%)和98.02%(2.72%)。见表1～3。

表1 没食子酸加样回收率Tab.1 Recovery of gallic acid

2.2.9 样品测定 精密吸取对照品溶液与地锦草供试品溶液10 μL，按上述色谱条件测定，并计算没食子酸、槲皮素和山柰素的含有量。结果见表4。

表3 山柰素加样回收率Tab.3 Recovery of kaempferol

表2 槲皮素加样回收率Tab.2 Recovery of quercetin

表4 测定结果Tab.4 Results of the determination(n=2)

3 结果与讨论

以3种酚酸类成分和总黄酮含有量为指标，利用spss15.0统计软件进行系统聚类分析，结果见图2。根据实验结果将5种地锦类植物分为四个类别:千根草为一类，地锦和斑地锦为一类，通奶草和18、20、21号大地锦为一类，19号大地锦为一类。初步将地锦草正品药材和其他3种地锦类植物区分开。

由于品种、采集地点、采集时间等是影响总黄酮的重要因素，故本实验用紫外分光光度法对地锦类药材中总黄酮进行了检测。实验结果提示总黄酮含有量顺序为通奶草＞大地锦＞地锦＞斑地锦＞千根草。由此可以看出，大地锦和通奶草的总黄酮含有量明显高于两个地锦草的正品来源，即地锦和斑地锦。为地锦草药材的新药源的开发提供了理论依据。

图2 聚类分析Fig.2 Cluster analysis

根据文献报道地锦草中酚酸类化合物大多以糖苷的形式存在，主要为槲皮素及苷、山柰素及苷等。直接测定地锦草药材中没食子酸、槲皮素、山柰素，发现其含有量很低，直接测定可能难以准确反映其中黄酮的实际含量，因此本实验采取酸水解后测定其没食子酸、槲皮素和山柰素，获得较为满意的效果。

对于水解条件的选择，采用的2010年版《中华人民共和国药典》的水解条件，盐酸浓度不宜过高，酸性太强对进样阀和色谱柱的腐蚀作用较大。色谱条件摸索时，发现流动相的pH值对色谱峰的峰形及分离度影响很大，比较甲醇-不同质量分数的磷酸溶液等多种溶剂系统，确定流动相为甲醇－0.4%磷酸 (V/V)梯度洗脱，得到的色谱峰峰形尖锐，分离度高，且基线较稳定［4-11］。

系统聚类分析是一种无管理、无指导的模式识别方法，可依赖所测样品的数据，对样品进行分类。本实验是根据3种酚酸成分和其总黄酮的含有量作为指标进行聚类分析。3种酚酸成分和其总黄酮测定结果显示，5种地锦类植物之间的3种酚酸类成分和总黄酮含有量差异较大，因此不能根据某一成分含有量的高低来评价其质量的好坏，所以本实验采用系统聚类分析法以3种酚酸类成分和总黄酮含有量作为综合指标对这5种地锦类植物进行了质量评价方法研究，根据实验结果在不考虑地锦草的生长环境及采收时间对其成分的影响的情况将5种地锦类植物分为四个类别。

本实验使用高效液相色谱法对地锦草的没食子酸、槲皮素和山奈素进行测定，使用统计软件对其各指标性成分及总黄酮含有量进行聚类分析并且得到较好的结果。对根据多指标成分应用系统聚类分析来判断中药材质量的方法进行了有益的尝试，初步将地锦草正品药材和其他三种地锦类植物区分开。为地锦类植物的质量评价和开发药材资源，鉴定药用植物真伪提供了技术支持和科学依据。

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