双波长HPLC法同时测定茱苓草中马钱苷酸和龙胆苦苷

崔春利， 王继涛， 王 敏， 刘文中， 唐志书， 郭东艳

(1.陕西中医学院，陕西咸阳712046;2.陕西中医学院第二附属医院，陕西咸阳712000;3.浙江工业大学，浙江杭州310014)

茱苓草，系龙胆科龙胆属植物秦岭龙胆Gentiana apiata N．E．Br．的全草，为秦巴山区特有的药用植物资源，其味苦，性平，入肝、大肠、膀胱三经，具有调经活血，清热明目，利小便之功，用于治疗头昏、失眠、小便不利、淋症、月经不调、痛经、崩漏、白带、痢疾、腹痛等［1］。其主要化学成分有萜类，黄酮类，三萜，糖类及谷甾醇类等［2-3］，其中环烯醚萜和裂环环烯醚萜类为龙胆属植物特征性成分，大多具有较强生理活性:马钱苷酸有提高皮肤机能、促进毛发生长、抑制中枢神经、镇痛和抗炎等作用;龙胆苦苷有促进胃液分泌、抗原虫和抗炎作用［4］。目前对于茱苓草的文献报道较少，多是化学成分的研究，但关于茱苓草定量测定尚未见相关文献报道，本实验结合文献［5-10］报道方法，建立了双波长HPLC法同时测定茱苓草中马钱苷酸和龙胆苦苷，且对茱苓草全草和地上部分两个部位进行了比较，方法的准确度与重复性考察均获得较满意的结果，适用于茱苓草中马钱苷酸和龙胆苦苷的定量分析。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters2695高效液相色谱仪 (美国Waters公司，Empower色谱工作站，Waters 2996 DAD);UV-2550紫外可见分光光度仪 (日本岛津);BT 25S(十万分之一)电子天平 (北京赛多利斯仪器有限公司);KDE型高功率数控超声波清洗器 (昆山禾创超声仪器有限公司)。

1.2 试药 马钱苷酸及龙胆苦苷对照品 (中国药品生物制品检定所，批号分别为111865-201001、110770-201013;纯度分别为90.9%、96.9%，供定量测定用);茱苓草全草药材2010年7月采自太白鳌山、市售茱苓草地上部分药材购自太白县药材收购门市部 (均由陕西中医学院王继涛高级实验师鉴定为龙胆科龙胆属植物秦岭龙胆Gentiana apiata N．E．Br．);甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 Hypersil GOLD aQ C18柱 (250 mm ×4.6 mm，5 μm);以甲醇-0.1%磷酸溶液 (20∶80)为流动相;体积流量为1 mL/min;柱温为30℃;检测波长为233 nm与272 nm。在此色谱条件下，马钱苷酸和龙胆苦苷均与样品中其他组分色谱峰基线分离，见图1。按马钱苷酸峰计算，理论板数为4 595，按龙胆苦苷峰计算，理论板数为9 648。

图1 高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.2 对照品溶液的制备及测定波长选择 精密称取马钱苷酸对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.166 mg的溶液;精密称取龙胆苦苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.219 mg的溶液。分别以所配制马钱苷酸和龙胆苦苷对照品溶液为母液，经适宜稀释，以甲醇为溶剂空白，采用UV-2550于紫外200～400 nm下进行扫描，结果马钱苷酸λmax=233 nm，龙胆苦苷λmax=272 nm，故采用233 nm和272 nm为检测波长。

2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末约0.24 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，称定质量，超声处理 (功率100 W，频率40 kHz)20 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过 (0.45 μm)，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 线性范围的考察 分别进样马钱苷酸对照品溶液和龙胆苦苷对照品溶液 3、5、10、15、20 μL，按上述色谱条件注入色谱仪，记录峰面积，分别以马钱苷酸、龙胆苦苷峰面积对进样量 (μg)回归，得马钱苷酸回归方程为:A=596 496.102 1 C－10 277.941 18，相关系数r=0.999 1，马钱苷酸在0.498～3.32 μg线性关系良好。龙胆苦苷回归方程为:A=1 882 505.81C－85 636.286 51，相关系数 r=0.999 9，龙胆苦苷在0.657～4.38 μg线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液连续进样5次，各5 μL，记录峰面积，结果马钱苷酸RSD为0.15%，龙胆苦苷RSD为0.12%，表明本试验仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验 称取本品适量，按供试品制备方法制备供试液，分别于0、4、8 h进样5 μL测定峰面积，结果马钱苷酸RSD为1.50%，龙胆苦苷RSD为0.75%。表明本品在8 h稳定性良好。

2.7 重复性试验 精密称取茱苓草药材5份，按供试品制备方法制成供试液，依法测定，马钱苷酸的平均质量分数为2.40%，RSD为0.69%。龙胆苦苷平均质量分数为1.92%，RSD为2.98%。结果表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 取一定量已知含有量的样品(马钱苷酸与龙胆苦苷质量分数分别为:24.556 1 mg/g、19.688 4 mg/g)精密加入适量对照品，依法制备供试液，测定含有量并计算回收率，结果见表1和表2。

表1 马钱苷酸的加样回收率试验结果 (n=6)Tab.1 Results of recovery tests of loganic acid(n=6)

表2 龙胆苦苷的加样回收率试验结果 (n=6)Tab.2 Results of recovery tests of gentiopicroside(n=6)

2.9 样品测定 取茱苓草全草粗粉0.24 g与其地上部分粗粉3.0 g，各6批，按供试品制备方法制备样品，依上述色谱条件测定，结果见表3。

表3 样品测定结果 (n=6)Tab.3 Results of contents determination of samples

3 讨论

本研究通过紫外扫描确定马钱苷酸λmax为233 nm，龙胆苦苷λmax为272 nm，因而采用233 nm、272 nm双波长HPLC同步检测技术对茱苓草中马钱苷酸与龙胆苦苷进行测定，方法科学，又极大简化了色谱分离检测步骤，提高了实验效率。一般高效液相色谱—可变波长紫外检测器系统均能实现，具有普遍适用性。最重要是，可以克服 (固定波长)单波长254 nm［11］同时检测这2个成分检测灵敏度较低的缺陷。

流动相系统的选择中，鉴于2010年版《中国药典》一部秦艽含量测定项中流动相采用乙腈-0.1%醋酸溶液［11］，考虑到系统0.1%醋酸溶液相对0.1%磷酸溶液有紫外本底吸收，同时鉴于醋酸具有挥发性，可随时间造成流动相pH缓慢改变，故最终选择0.1%磷酸溶液作为色谱系统的流动相。

从样品测定结果，茱苓草全草与茱苓草地上部分2个药材部位含有量差异悬殊，无论马钱苷酸还是龙胆苦苷，推测其所含有的这2种环烯醚萜苷类成分主要集中于其根部，提示以全草入药为好。

与茱苓草同属的龙胆药材 (Gentianae Radix et Rhizoma)，系龙胆科植物龙胆 (Gentianae scabra Bge．)的根及根茎，临床主要以其干燥根和根茎入药。李文龙［12］对全国6个不同产地的龙胆药材中龙胆苦苷和马钱子苷酸含有量进行了比较研究，将其结果与本实验茱苓草含有量比较，可以看出陕西太白山特有这个种的茱苓草的全草中马钱苷酸量高出龙胆药材6个产地中任一产地，而龙胆苦苷含有量略低于其6个产地的平均值，显而易见，龙胆属这2个不同种的药材中环烯醚萜苷成分差异明显，提示两者的药理效应可能存在差异，那么今后有待对茱苓草药理效应进一步研究。

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