烟草突变体筛选与鉴定方法篇：4.烟草抗干旱突变体筛选与鉴定

李廷春，杨华应

（安徽省农业科学院烟草研究所，合肥 230031）

烟草经甲基磺酸乙酯（EMS）诱变处理可以分离得到多种突变体，这些突变体的获得将为揭示烟草生长发育规律奠定基础。烟草突变体的筛选已成为许多重要理论问题得以解决的前体，而筛选方法是突变体筛选成败的关键。

干旱是影响植物生长发育的主要环境因子之一[1]。烟草在生长过程中，特别是从团棵期进入旺长期常常遭遇干旱，干旱已经成为影响其营养生长的重要因素。利用突变体材料筛选烟草抗旱突变体，不仅可为抗旱基因克隆及功能分析奠定基础，还对于进一步探索水分胁迫信号转导及应答干旱胁迫的分子机制具有重要的意义。

1 抗干旱突变体的高通量筛选

对拟南芥突变体的研究表明，每5万株经EMS诱变的拟南芥M2代，其基因中的每一个基因至少有一次发生突变的机会[2]。对于如此大规模的突变体筛选工作，尤其对烟草这种植株较大的植物，建立一种快速、有效的筛选方法是获得具备优良性状突变体的关键。

烟草抗干旱筛选根据其处理方式可分为自然干旱和高渗溶液处理模拟干旱，由于自然干旱所需时间周期长，个体差异较难控制，误差较大，所以采用高渗溶液处理模拟干旱是较为常用的方法。目前，常用于模拟干旱的高渗溶液是PEG6000溶液，PEG6000是一种高分子量的非渗透调节剂，对水分表现出强烈的亲和性，由于其对植物无毒害的特点，已被广泛用于模拟干旱逆境条件，进行抗旱材料筛选与干旱响应机制的研究[3-7]。根据PEG6000溶液处理时期的不同，抗旱筛选主要有：（1）发芽期抗旱试验，采用PEG6000溶液处理烟草种子，根据发芽率、发芽势筛选抗旱突变体；（2）烟草种子发芽后，待子叶完全展开时，采用PEG6000溶液处理烟草小苗，根据植株萎蔫状态、生长量变化筛选抗旱突变体；（3）苗期抗旱试验，待烟草幼苗长至6～8片叶时，采用PEG6000溶液处理，根据叶片生长状态、相关生理指标（相对含水量、脯氨酸含量等）筛选抗旱突变体。试验结果表明，发芽期抗旱试验受种子活力影响较大，苗期抗旱试验存在周期长、工作量大等缺点，因此，采用25%PEG6000处理发芽后小苗进行抗旱筛选是筛选烟草抗旱突变体较为理想的方法。具体方法如下：精选大小一致、籽粒饱满、无破损的种子，采用9 cm滤纸作为载体，种子发芽后，待子叶完全展开时，加入25%PEG6000的水溶液，连续培养5 d后，依据小苗萎蔫、根长生长情况筛选抗旱的烟草突变体材料。

2 烟草抗干旱突变体的鉴定

烟草抗干旱是个复杂的生理过程，与气孔蒸腾、根系活力、脯氨酸积累等均存在密切的关系，植株的抗旱性可通过田间表型、细胞组织学鉴定、生理生化指标测定以及抗旱相关基因的克隆与表达分析来进行验证[8-11]。

2.1 田间表型鉴定

结合田间和旱棚，对抗干旱突变体材料进行至少2年以上的表型鉴定，包括农艺性状测量、干物质积累测定和计产试验等。

2.2 细胞组织学鉴定

采用显微技术，对正常、干旱条件下的抗干旱突变体材料叶片组织的气孔特征进行观察，并对细胞组织鉴定。

2.3 生理生化鉴定

通过测定干旱条件下，抗干旱突变体材料的抗氧化酶系统、脯氨酸含量、相对含水量、蒸腾速率、根系活力等生理指标，进行烟草抗干旱突变体的生理生化鉴定。

2.4 抗旱相关基因的克隆与分析

采用图位克隆、TILLING技术、基因芯片技术等筛选、克隆抗旱相关基因，并采用半定量PCR与实时荧光PCR技术，对干旱条件下烟草抗干旱突变体材料的渗透调节基因、抗旱相关转录因子，以及逆境应答信号因子基因的表达特性进行研究、分析，鉴定烟草突变体的抗旱性。

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