基于HPLC指纹图谱及多指标成分对黄柏饮片的等级研究

高源，胡昌江，吴珊珊，李文兵，周一帆

(成都中医药大学药学院，四川成都611137)

黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chineseSchneid.的干燥树皮，习称“川黄柏”［1］。始载于《神农本草经》，列为上品，具有性味苦、寒，具有清热燥湿、泻火解毒之功效［2］，其后历代本草均有记载［3-4］。黄柏中的主要活性部位为生物碱类化合物，包括盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱和盐酸黄柏碱等主要成分［5］。黄柏饮片为传统中药，广泛应用于中医临床和中成药生产，因此在流通市场上是否按着优质优价的方式管理黄柏饮片，直接影响到临床疗效和中医药的发展。由此看来对黄柏饮片分级的研究势在必行［6］。

调查发现，目前绝大部分中药材饮片市场和企业都是以产地和生长年限(树皮厚度)作为价格定制和质量评价的依据，把黄柏饮片分为一等和统货。一等为10年以上道地产区(荥经)，且刮净粗栓皮，无枝皮的黄柏饮片;统货为其他产区黄柏及10年以下，间有枝皮的荥经黄柏。一等黄柏饮片价格明显高于统货。本实验采用高效液相色谱(HPLC)法，按照中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)［7］，对不同等级黄柏饮片进行指纹图谱相似度分析、聚类分析［8］和多指标成分分析［9］，从而验证该方法的合理性和科学性。为规范黄柏饮片质量和市场管理提供依据。

1 仪器、试剂与试药

美国Aglient 1200高效液相色谱仪(含G1312B二元泵，G1315C型DAD检测器);KQ-300E超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);BP-61电子天平(感量0.0001g，德国Sartorius公司)。

盐酸小檗碱(中国药品生物制品检定所，批号为110713—200911)、盐酸黄柏碱(成都曼斯特生物科技有限公司，批号为MUST-12021407);盐酸药根碱(成都曼斯特生物科技有限公司，批号为MUST-10122001);盐酸巴马汀(成都曼斯特生物科技有限公司，批号为MUST-11122703)。

水为超纯水;乙腈为色谱纯;其他为分析纯。

2 方法与结果

2.1 样品收集与前处理实验收集了2个等级18批黄柏药材，经成都中医药大学卢先明教授鉴定为黄皮树Phellodendron chinenseSchneid.的干燥树皮，见表1。药材按照《中国药典》［1］要求切成黄柏丝，经晒干后，置阴凉干燥处储藏，实验前在40℃［10］的烘箱中烘30 min，粉碎，过三号筛，备用。

表1 18批黄柏样品来源Tab.1 Resourcres of 18 batches of Phellodendri chinensis Cortex pieces

2.2 HPLC指纹图谱的建立

2.2.1 色谱条件Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);检测波长为230 nm;柱温为30℃;体积流量为1 mL/min;进量样为5 μL;流动相为乙睛(A)-1.04 mol/LNH4Cl水溶液［11］(B)梯度洗脱，0～6 min(12%～18%A)，6～10 min(18%～20%A)，10～15 min(20%～20%A)，15～25 min(20%～25%A)，25～35 min(25%～40%A)，35～50 min(40%～55%A)。

2.2.2 混合对照品溶液的制备精密称取适量盐酸小檗碱、盐酸黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱4个对照品溶于甲醇配成混合对照品溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备精密称取18批黄柏样品粉末(过三号筛)约0.5 g，置250 mL具塞锥形瓶中，精密量取1%盐酸-甲醇20 mL，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)40 min，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，进样前用0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液即为18个供试品溶液，备用。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验精密称取黄柏样品S1，根据2.2.3项下制备样品供试液，在上述色谱条件下，连续进样5次，记录指纹图谱。结果表明10个共有峰相对保留时间和相对峰面积基本一致，相对保留时间RSD均小于3.0%和相对峰面积RSD均小于5.0%，符合指纹图谱要求，表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验精密称取5份黄柏样品S1，按照2.2.3项下制备样品供试液，在上述色谱条件下进样，记录指纹图谱。结果表明10个共有峰相对保留时间和相对峰面积基本一致，相对保留时间RSD均小于3.0%和相对峰面积RSD均小于5.0%，符合指纹图谱要求，表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验精密称取黄柏样品S1，按照2.2.3项下制备样品供试液，分别按上述色谱条件在0、4、8、12、24 h进样测定，记录指纹图谱。结果10个共有峰的相对保留时间RSD均小于3.0%和相对峰面积RSD均小于5.0%，符合指纹图谱要求，表明样品供试液指纹图谱在24 h内是稳定的。

2.4 指纹图谱的测定将混合对照品溶液和18批黄柏样品的供试品溶液按照2.2.1项，进行HPLC测定，记录各色谱指纹图谱。按照中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)［7］对18批黄柏样品色谱图进行分析，确定10个共有峰，见图1、图2。2号、7号、8号、9号峰与混合对照品对照分别鉴定为盐酸黄柏碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱。以9号峰(S)盐酸小檗碱作为参照峰，记为S。见图1～3。

图1 混合对照品HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram of the m ixed reference substances

2.5 相似度计算与评价采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)(国家药典委员会)，建立共有模式作为对照指纹图谱(见图3)，将18批黄柏样品图谱与对照指纹图谱比较，计算各黄柏样品中共有峰的峰面积值和相似度，结果见表2、表3。

图2 18批黄柏饮片HPLC指纹图谱Fig.2 HPLC fingerprint of 18 batches of Phellodendri Chinensis Cortex pieces

图3 对照指纹图谱Fig.3 Reference fingerprint

表2 18批黄柏饮片指纹图谱主要共有峰峰面积结果Tab.2 Results of the peak areas of m ainly common peaks on HPLC fingerprints of 18 batches of Phellodendri chinensis Cortex pieces

表3 18批黄柏饮片指纹图谱与参照图谱的相似度结果Tab.3 Sim ilarity results of HPLC fingerprints and reference chromatogram on 18 batches of Phellodendri Chinensis Cortex pieces

表3结果显示相似度均大于0.997，其中S1、S2、S3、S4、S5、S6、S13号样品相似度为1。

2.6 聚类分析以黄柏样品10个共有峰的峰面积值(表2)为聚类指标，运用SPSS 13.0统计分析软件对18批样品进行聚类分析，结果见图4。图4显示，当距离标尺在9时，14批黄柏饮片聚为两类，第1类为样品S1～S6，第2类为样品S7～S18。

图4 18批黄柏饮片HPLC指纹图谱聚类分析图Fig.4 Clustering analysis chart HPLC fingerprints of 18 batches of Phellodendri chinensis Cortex pieces

2.7 4个指标成分峰面积值分析以批次为横坐标，以表1中盐酸黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、盐酸小檗碱4个色谱峰峰面积总值为纵坐标，得出18批黄柏4个共有峰峰面积总值折线图，见图5。结果显示一等(S1～S6)4个共有峰峰面积总值均在4 300以上，统货(S7～S18)均在4 300以下。

3 结论

图5 18批黄柏饮片中盐酸黄柏碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱、盐酸小檗碱峰面积总值折线图Fig.5 Line graph of peak area values totally on phellodendrine hydrochloride、palmatine hydrochloride、jatrorrhizine hydrochloride、berberine hydrochloride of 18 batches of Phellodendri chinensis Cortex pieces

相似度分析结果表明各批次黄柏指纹图谱整体图貌基本一致，区别在于各成分含量不同。聚类分析结果表明，18批黄柏饮片明显聚为2类。分析4个指标成分峰面积总值结果得出，不同产区黄柏中峰面积总值差异较大，一等黄柏饮片中峰面积总值明显大于二等，这与聚类分析结果一致。综上所述，一等黄柏饮片和二等差别明显，且一等质量明显优于二等，从而证明了传统黄柏饮片分级方法的合理性与科学性。这为黄柏等级标准的建立和按质论价管理提供一定依据。

本实验结合现代分析技术对不同产地黄柏饮片内在质量进行研究，各产区成分含有量差异较大，其中荥经黄柏各成分含有量明显高于其他产地，证实了荥经黄柏的道地性，可能与荥经独特的地理环境和气候有关，形成了荥经黄柏“肉厚色深”优良品质［12］。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:286.

［2］吴普等述，孙星衍等辑.神农本草经［M］.北京:人民卫生出版社，1982:43.

［3］李时珍.本草纲目［M］.北京:人民卫生出版社，1977:3.

［4］唐慎微.重修政和经史证类备用本草［M］.北京:人民卫生出版社，1957:299.

［5］龚千锋.中药炮制学［M］.北京:中国中医药出版社，2003:220-221.

［6］李丽，张村，肖永庆.中药饮片分级规格质量评价及其优质优价管理［C］//2010全国知名中医院院长暨道家文化与中医药养生论坛，2010:89-92.

［7］国家药品监督管理局.中药注射指纹图谱研究的技术要求(暂行)［J］.中成药，2000，22(10):671-675.

［8］张文彤.SPSS 11.0统计分析教程(高级篇)［M］.北京:北京希望电子出版社，2003:171.

［9］范积平，张贞良，廖晓玲.不同产地黄柏药材中4种主要生物碱类成分的含量测定［J］.广东药学院学报，2010，6(1):54-57.

［10］刘钊圻，叶萌，林海建，等.黄柏加工方法的优化研究［J］.林业实用技术，2007(6):7-9.

［11］杨宏，王天志，常艳波，等.川黄柏的HPLC指纹图谱［J］.中国天然药物，2006，4(5):360-362.

［12］方清茂，曹浩，舒光明.川黄柏中盐酸小檗碱的含量及其道地性研究［J］.华西药学杂志，2004，19(4):275-276.