肝纤维化进程中细胞衰老的作用及相关机制的研究进展

孔德松，魏东华，张 峰，张自力，陆 茵，3，王爱云，3，陈文星，3，郑仕中，3

(1.南京中医药大学中药学一级学科，江苏 南京 210029;2.哈尔滨医科大学大庆校区药学院中药学与药用植物学系，黑龙 江大庆 163319;3.南京中医药大学江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏 南京 210046)

细胞衰老是生物界的普遍规律。细胞作为有机体的基本结构单位，从其新生开始，就在经历着衰老的过程，直至死亡。自从Hayflick等［1］首次在人类成纤维细胞中观察到细胞衰老的现象后，人们对各类细胞的衰老现象进行了更为深入的研究。衰老细胞虽然能保持一些基本的代谢活性，但无论是在形态还是在功能上已经发生了很多根本性的改变。衰老细胞主要有以下4个特征:①细胞被稳定地阻滞于细胞周期G1期和G2/M中的某个时期;② 细胞的一些结构与功能发生改变;③衰老细胞不易发生凋亡;④与细胞衰老相关的分泌功能发生改变［2-3］。因此，衰老细胞处于一种相对稳定的状态。与细胞衰老相关的调控途径主要有两条:p16-pRb途径与p53-p21-pRb途径，其中p53和pRb基因是两条调控途径的核心，在诱导与维持细胞衰老的进程中起着重要作用［4-6］。

肝中各类型细胞的衰老在肝纤维化等慢性肝疾病的发生与发展中发挥着重要作用［7］。肝纤维化是各种损伤因子持续作用而引起的损失修复反应，表现为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的大量沉积。肝纤维化的发展进程是以肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)活化增殖为中心环节，以肝细胞、胆管上皮细胞及其他各种细胞和细胞间相互作用的信号因子相互作用与影响的结果。如无有效的治疗措施，随着病情的发展将导致肝纤维结节形成并破坏正常的肝结构与功能，最终发展成为肝硬化而出现肝功能的衰退，甚至有演变为肝癌的可能［8］。加强HSC、肝细胞等细胞衰老机制的研究，对肝纤维化的实验研究与寻找肝纤维化防治的新机制有着重要意义。本文将对近期细胞衰老与肝纤维化的关系及相关机制进行综述。

1 细胞衰老抑制肝星状细胞增殖并加速其清除

肝纤维化的主要表现是ECM的大量沉积，HSC及肌成纤维细胞(myofibroblasts，MFB)是胶原分泌的主要细胞类型。抑制HSC的活化、增殖及向MFB的转变是目前肝纤维化研究与防治的主要措施［9］。衰老细胞被稳定阻滞于细胞周期的G1期和G2/M中的某个时期，不再具有增殖活性。因此，细胞衰老与HSC的活化增殖的关系正在受到国内外学者的广泛关注。Sekoguchi等［10］研究发现，细胞周期的周转是端粒缩短的主要原因，可使细胞进入衰老状态并能减轻肝纤维化的发展，而氧化应激可加速这一进程，尤其在肝纤维化晚期。Park等［11］研究发现，衰老标志蛋白30(senescence marker protein 30)基因敲除的小鼠体内维生素C的含量下降，进而促进过氧化物酶增殖因子的高表达，肝纤维化的发生与发展得到减轻。可见，肝纤维化与细胞衰老之间关系密切。Jun等［12］指出在肝和皮肤受损时，起初MFB增殖并分泌ECM，最终它们走向衰老抑制其进一步增殖，此过程可能受到CCN1蛋白的表达调控。Krizhanovsky等［13］研究发现，表达细胞衰老重要标志物细胞衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-GAL)的区域，肝纤维化重要标志物 α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达则降低，ECM沉积明显减少;而在细胞衰老基因p53敲除的实验性肝纤维化小鼠中，HSC的衰老被阻断，肝纤维化程度明显加重;活化HSC的增殖通路(如AKT通路)的过表达触发细胞衰老的开始。Schnabl等［14］同样发现与处于活化态的HSC相比，衰老的HSC中胶原、纤连蛋白、细胞黏合素的表达也明显降低，原位末端标记法结果显示，衰老的HSC中有21%出现DNA破裂与凋亡的现象，而处于活化态的HSC中只有4% ～5%，另外衰老的HSC的炎症相关基因的表达也更高。HSC是肝纤维化发生与发展中的主要细胞，诱导HSC的衰老可阻断其增殖活化，对肝纤维化的防治意义重大。

研究表明，进入衰老阶段的HSC与肝纤维化炎症微环境之间存在相互关联［15-16］。Cuesta等［17］将快速老化小鼠与抗快速老化小鼠进行对比，发现快速老化小鼠肝中炎症相关的细胞因子肿瘤坏死因子、一氧化氮合酶、白介素1β(IL-1β)、人血红素氧合酶、人单核细胞趋化蛋白、核转录因子(NF-κB2)和NF-κB激活蛋白的表达上调。此外，Krizhanovsky等［13］研究发现，在衰老的 HSC中自然杀伤细胞的NKG2D受体的配基表达上调，同时NKG2DU受体的配基LBP2和黏附分子CD58(参与自然杀伤细胞与其靶细胞之间相互作用)的表达也增加，与炎症相关的细胞因子如IL-11，IL-8和IL-6在衰老的HSC中也过量表达。另外，衰老的HSC可诱导自然杀伤细胞等免疫细胞向其聚集，加快衰老细胞的清除。HSC等类型细胞的清除，可减少其通过自分泌、旁分泌对自身和其他细胞的刺激活化，抑制肝纤维化的发生与发展。

2 细胞衰老与上皮间质转化

上皮-间质转化是指在某些特殊的生理或病理条件下，上皮细胞向间质细胞转化的现象。上皮间质转化在肝纤维化等肝脏疾病的损伤修复反应中起着重要的作用。同时在肝纤维化进程中上皮细胞可通过上皮-间质转化途径转变为 MFB，促进肝纤维化的发生与发展［18］。Allan 等［19］指出，在纤维化疾病中，胰岛素样生长因子结合蛋白5(insulin-like growth factor-binding protein-5，IGFBP5)与转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)有着相似的作用，可诱导成纤维细胞的活化和上皮-间质转化途径的发生，调节纤维化的发生与发展。同时有学者发现敲除人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)中的IGFBP5基因可阻断其衰老进程的发展，相反导入外源性的IGFBP5可诱导HUVEC的提前衰老，提示在上皮-间质转化途径中有着重要作用的IGFBP5在细胞衰老的调控中也扮有重要角色，上皮-间质转化途径与细胞衰老之间或许存在着密切联系［20］。Gutierrez-Reyes等［21］对肝病晚期儿童的肝样本研究发现，在肝硬化的肝样本中，胆管内皮细胞(bile duct epithelial cells，BEC)和肝细胞表达 SA-β-GAL，而在肝纤维化区域则很少有SA-β-GAL的表达;p53具有与SA-β-GAL相同的作用，p16INK4a和p21cip1在移植肝的肝细胞、胆管中的表达也上升。这也证明在胆汁淤积型肝硬化中，BEC存在衰老现象。Sasaki等［22］研究发现，在慢性肝疾病晚期特别是原发性胆汁性肝硬化中，BEC高表达细胞衰老的重要标志物p16INK4a和p21WAF1/Cip1，并表达细胞周期G1期重要标志物周期蛋白D，且一些细胞被阻滞于G1期，这些衰老细胞与肝纤维化的发生与发展有着紧密联系。此外，该研究组还发现有些BEC表达间质细胞的标志物神经细胞黏附因子，并认为细胞衰老与上皮-间质转化之间存在一定联系。而Ansieau等［23］则提出细胞衰老可抑制上皮-间质转化的发生，发现转录因子Twist1和Twist2可诱导上皮细胞经上皮-间质转化途径转变为肿瘤细胞，又可抑制癌基因过表达所致的细胞衰老，从而促进上皮-间质转化的发生。Smit等［24］研究发现，转录因子Twist和Zeb1都可抑制细胞衰老，诱导上皮-间质转化的发生，使上皮细胞获得间质细胞表型，侵袭与迁移能力增强。在肝纤维化的治疗中如果能通过细胞衰老的调控抑制上皮-间质转化的发生，对于减少MFB的来源，抑制肝纤维化的发生与发展意义重大。因此，深入开展细胞衰老与上皮-间质转化之间的调控关系的研究，进一步阐明其分子机制十分必要。

3 肝细胞衰老与肝纤维化

虽然肝细胞不是肝ECM的细胞学来源，但是肝细胞损伤在肝纤维化发生中仍然具有重要作用。肝细胞炎症坏死既是肝纤维化与肝硬化的启动因素，又是其向前进展的推动因素［25-26］。Yoon等［27］研究发现，铁螯合剂可诱导肝细胞系的衰老，使细胞阻滞于 G1期，这是由于 TGF-β1诱导p27Kip1(对细胞周期有抑制作用)的表达增加，而不依赖p53途径。Wiemann等［28］研究发现，在肝纤维化区域各种原因导致的肝细胞受损使肝细胞的端粒固缩明显，且要短于巨噬细胞和HSC，肝细胞进入衰老阶段，肝细胞再生也减少，衰老的肝细胞可激活HSC等其他类型的细胞导致肝纤维化的加剧。更加严重的是由于免疫微环境的改变以及肝纤维化进程的不断恶化，肝细胞可能跨过衰老阶段发展为肝癌细胞［29］。另外，有学者研究发现，衰老细胞可大量分泌IL-6，并通过IL-6引起其他细胞的衰老，称之为“衰老传染”，这预示着一旦肝细胞走向衰老，衰老相关细胞分泌功能的改变会使肝内微环境发生变化，进而通过反馈调节机制促进其他肝细胞启动衰老进程，将有更多衰老的肝细胞参与到肝纤维化的发生与发展之中［30］。肝细胞在肝中数量最多(约占肝细胞总量的80%)，功能最重要，加强肝细胞衰老与肝纤维化的相关研究对抑制肝纤维化发生与发展起着重要作用。

4 展望

肝纤维化发生时，各种损伤因子持续作用于肝，导致免疫微环境等的改变，促使肝细胞大量凋亡，BEC异常增生，以及HSC的增殖超过其被清除的效率［8］。肝纤维化的发生与发展机制复杂，因此针对肝纤维化的治疗应综合考虑才能取得满意效果。有研究显示，细胞增殖衰老的紊乱可能导致肝纤维化的加重或肝癌的发生［29］。各种原因导致的DNA损伤可以活化细胞衰老相关基因，其中p16-pRb途径与p53-p21-pRb途径共同调节细胞的衰老进程。近年来，用于细胞衰老研究的细胞模型已扩展至各类细胞，且在肝纤维化中的作用也日益受到关注。

HSC的衰老可抑制其活化并加速其清除;细胞衰老相关蛋白还参与上皮-间质转化途径的调控，对减少MFB的来源意义重大;肝细胞的衰老也在肝细胞再生与HSC的活化中扮演重要角色，这些作用显示了细胞衰老调控在肝纤维化治疗中的潜在应用前景。但如果将调控肝内各细胞的衰老进程作为治疗肝纤维化的策略，同样存在一些风险，如在获得有益效应的同时，可能将付出相关器官功能减退，诱发癌变，患者的生存率也同步下降的代价，但这并不妨碍人们对其不断的探索和研究［31］。总之，加强肝纤维化中各类细胞的衰老机制的相关研究，可为肝纤维化的防治探索了新的途径，相信随着细胞衰老与肝纤维化关系的的逐步阐明及相关治疗措施的不断深入研究，有效控制肝纤维化进而防止肝硬化将成为可能。

综上所述，细胞衰老调控在肝纤维化及相关肝病的发病进程中扮有重要角色，但这种作用及其作用机制目前仍不是很明了。为此，可以从以下方面开展相关研究:①加强参与肝纤维化相关的其他类型细胞如枯否细胞、窦内皮细胞等的细胞衰老机制的研究，综合研究细胞衰老在肝纤维化中的作用。②细胞衰老程度的检测与判断仍是目前面临的一个较大困难。因此，可以应利用基因克隆等技术手段进行细胞衰老相关基因的深入研究，并探究对肝纤维化进程的调控。③继续开展肝微环境的改变对细胞衰老及肝纤维化影响的实验研究，明确三者之间的相互关系。④进行调节细胞衰老以诊治肝纤维化的相关药物的研究，特别是从传统中药中筛选发现具有此种作用的活性成分，可能在减少药物毒性作用，提高治疗效果方面有着重要意义。对于细胞衰老在肝纤维化中作用的研究有着重要的理论与实践意义，今后应进一步加强相关实验与临床研究，从而使其能更好地造福人类。

［1］Hayflick L，Moorhead PS.The serial cultivation of human diploid cell strains［J］.Exp Cell Res，1961，25:585-621.

［2］Campisi J，d'Adda di Fagagna F.Cellular senescence:when bad things happen to good cells［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8(9):729-740.

［3］Ben-Porath I，Weinberg RA.The signals and pathways activating cellular senescence［J］.Int J Biochem Cell Biol，2005，37(5):961-976.

［4］Chen J，Huang X，Halicka D，Brodsky S，Avram A，Eskander J，et al.Contribution of p16INK4aand p21CIP1pathways to induction of premature senescence of human endothelial cells:permissive role of p53［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290(4):H1575-H586.

［5］Bennecke M，Kriegl L，Bajbouj M，Retzlaff K，Robine S，Jung A，et al.Ink4a/Arf and oncogene-induced senescence prevent tumor progression during alternative colorectal tumorigenesis［J］.Cancer Cell，2010，18(2):135-146.

［6］Takahashi A，Ohtani N，Yamakoshi K，Iida S，Tahara H，Nakayama K，et al.Mitogenic signalling and the p16INK4a-Rb pathway cooperate to enforce irreversible cellular senescence［J］.Nat Cell Biol，2006，8(11):1291-1297.

［7］Hoare M，Das T，Alexander G.Ageing，telomeres，senescence，and liver injury［J］.J Hepatol，2010，53(5):950-961.

［8］Pinzani M.Foreword to liver fibrosis［J］.Best Pract Res Clin Gastroenterol，2011，25(2):193-194.

［9］Foo NP，Lin SH，Lee YH，Wu MJ，Wang YJ.α-Lipoic acid inhibits liver fibrosis through the attenuation of ROS-triggered signaling in hepatic stellate cells activated by PDGF and TGF-β［J］.Toxicology，2011，282(1-2):39-46.

［10］Sekoguchi S，Nakajima T，Moriguchi M，Jo M，Nishikawa T，Katagishi T，et al.Role of cell-cycle turnover and oxidative stress in telomere shortening and cellular senescence in patients with chronic hepatitis C［J］.J Gastroenterol Hepatol，2007，22(2):182-190.

［11］Park JK，Ki MR，Lee HR，Hong IH，Ji AR，Ishigami A，et al.Vitamin C deficiency attenuates liver fibrosis by way of up-regulated peroxisome proliferator-activated receptor-gamma expression in senescence marker protein 30 knockout mice［J］.Hepatology，2010，51(5):1766-1777.

［12］Jun JI，Lau LF.Cellular senescence controls fibrosis in wound healing［J］.Aging(Albany NY)，2010，2(9):627-631.

［13］Krizhanovsky V，Yon M，Dickins RA，Hearn S，Simon J，Miething C，et al.Senescence of activated stellate cells limits liver fibrosis［J］.Cell，2008，134(4):657-667.

［14］Schnabl B，Purbeck CA，Choi YH，Hagedorn CH，Brenner D.Replicative senescence of activated human hepatic stellate cells is accompanied by a pronounced inflammatory but less fibrogenic phenotype［J］.Hepatology，2003，37(3):653-664.

［15］Kuilman T，Michaloglou C，Vredeveld LC，Douma S，van Doorn R，Desmet CJ，et al.Oncogene-induced senescence relayed by an interleukin-dependent inflammatory network［J］.Cell，2008，133(6):1019-1031.

［16］Risques RA， Lai LA，Himmetoglu C，Ebaee A，Li L，Feng Z，et al.Ulcerative colitis-associated colorectal cancer arises in a field of short telomeres，senescence，and inflammation［J］.Cancer Res，2011，71(5):1669-1679.

［17］Cuesta S，Kireev R，Forman K，García C，Escames G，Ariznavarreta C，et al.Melatonin improves inflammation processes in liver of senescence-accelerated prone male mice(SAMP8)［J］.Exp Gerontol，2010，45(12):950-956.

［18］Rygiel KA，Robertson H，Marshall HL，Pekalski M，Zhao L，Booth TA，et al.Epithelial-mesenchymal transition contributes to portal tract fibrogenesis during human chronic liver disease［J］.Lab Invest，2008，88(2):112-123.

［19］Allan GJ，Beattie J，Flint DJ.Epithelial injury induces an innate repair mechanism linked to cellular senescence and fibrosis involving IGF-binding protein-5［J］.J Endocrinol，2008，199(2):155-164.

［20］Kim KS，Seu YB，Baek SH，Kim MJ，Kim KJ，Kim JH，et al.Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism［J］.Mol Biol Cell，2007，18(11):4543-4552.

［21］Gutierrez-Reyes G，del Carmen Garcia de Leon M，Varela-Fascinetto G，Valencia P，Pérez Tamayo R，Rosado CG，et al.Cellular senescence in livers from children with end stage liver disease［J］.PLoS One，2010，5(4):e10231.

［22］Sasaki M，Ikeda H，Yamaguchi J，Miyakoshi M，Sato Y，Nakanuma Y.Bile ductular cells undergoing cellular senescence increase in chronic liver diseases along with fibrous progression［J］.Am J Clin Pathol，2010，133(2):212-223.

［23］Ansieau S，Bastid J，Doreau A，Morel AP，Bouchet BP，Thomas C，et al.Induction of EMT by twist proteins as a collateral effect of tumor-promoting inactivation of premature senescence［J］.Cancer Cell，2008，14(1):79-89.

［24］Smit MA，Peeper DS.Deregulating EMT and senescence:double impact by a single twist［J］.Cancer Cell，2008，14(1):5-7.

［25］Tamaki N， Hatano E， Taura K，Tada M，Kodama Y，Nitta T，et al.CHOP deficiency attenuates cholestasis-induced liver fibrosis by reduction of hepatocyte injury［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2008，294(2):G498-G505.

［26］Lavallard VJ，Bonnafous S，Patouraux S，Saint-Paul MC，Rousseau D，Anty R，et al.Serum markers of hepatocyte death and apoptosis are non invasive biomarkers of severe fibrosis in patients with alcoholic liver disease［J］.PLoS One，2011，6(3):e17599.

［27］Yoon G，Kim HJ，Yoon YS，Cho H，Lim IK，Lee JH.Iron chelation-induced senescence-like growth arrest in hepatocyte cell lines:association of transforming growth factor beta1(TGF-beta1)-mediated p27Kip1 expression［J］.Biochem J，2002，366(Pt 2):613-621.

［28］Wiemann SU，Satyanarayana A，Tsahuridu M，Tillmann HL，Zender L，Klempnauer J，et al.Hepatocyte telomere shortening and senescence are general markers of human liver cirrhosis［J］.FASEB J，2002，16(9):935-942.

［29］Lechel A，Holstege H，Begus Y，Schienke A，Kamino K，Lehmann U，et al.Telomerase deletion limits progression of p53-mutant hepatocellular carcinoma with short telomeres in chronic liver disease［J］.Gastroenterology，2007，132(4):1465-1475.

［30］Kuilman T，Michaloglou C，Vredeveld LC，Douma S，van Doorn R，Desmet CJ，et al.Oncogene-induced senescence relayed by an interleukin-dependent inflammatory network［J］.Cell，2008，133(6):1019-1031.

［31］Wiemann SU，Satyanarayana A，Buer J，Kamino K，Manns MP，Rudolph KL.Contrasting effects of telomere shortening on organ homeostasis，tumor suppression，and survival during chronic liver damage［J］.Oncogene，2005，24(9):1501-1509.