张 铖 李凤婷 李 梦 岳顺卿 耿建国* 章九红
(1.首都医科大学中医药学院中医临床基础教研室,北京100069;2.河南省平顶山市医学会,平顶山467000)
糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的主要微血管病变之一,是以肾小球硬化症为主要病理变化的严重合并症,也是引起终末期肾病和糖尿病患者死亡的主要原因之一[1]。研究[2]显示,纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)、层粘连蛋白(laminin,LN)和Ⅳ型胶原等细胞外基质在肾组织内积聚可以导致肾小球硬化,进而引起DN发生。因此,减少细胞外基质的积聚是延缓DN发生的关键环节。本实验采用免疫组织化学方法,观察加味消渴康对糖尿病肾病大鼠肾组织FN、LN及Ⅳ型胶原表达的影响,现将实验结果报告如下。
SD雄性大鼠24只,体质量160~180 g,鼠龄2~3月龄,购自首都医科大学实验动物部〔动物的合格证号:SCXX(京)2006-0009〕。加味消渴康由生黄芪10 g、山萸肉30 g、生薏仁30 g、水蛭6 g、葛根30 g、丹参10 g、决明子10 g组成,药材购自北京祥威药业公司;氯沙坦购自杭州默沙东制药有限公司(生产批号:09422)。链脲佐菌素(STZ,美国Sigma公司);兔抗FN多克隆抗体(美国abcam公司);兔抗LN多克隆抗体(美国abcam公司);兔抗Ⅳ型胶原多克隆抗体(美国abcam公司)。
1)糖尿病肾病动物模型的建立:将造模大鼠适应性饲养1周后,行右侧肾脏切除术。术后2周,禁食12 h,按50 mg/kg体质量的剂量进行单次腹腔内注射。72 h后,尾静脉采血,用sure-step血糖仪测定大鼠血糖,用尿糖试纸测大鼠随意尿糖,血糖浓度≥16.7 mmol/L,尿糖定性>+++,确定DN造模成功。
2)分组及给药:将成模大鼠用数字表法随机分为4组,每组6只。正常组(A组)、模型组(B组)、氯沙坦组(C组,给药量为成人药量/60 kg×6.25,即5.2 mg/kg)、中药组(D组,给药量为成人药量/60 kg× 6.25,13.125 g·kg-1·d-1)每日1次,连续灌胃12周,正常组及模型组每日灌服等量蒸馏水。
各组大鼠于给药后第12周末进行肾脏取材。肾组织常规制片,运用免疫组织化学法测定肾组织FN、LN和Ⅳ型胶原的蛋白表达,400倍镜下随机选择10个视野,并用图文处理系统进行分析。
采用SPSS 13.0 for Windows进行统计处理,计量数据采用均数±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析法和LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
血糖方面,模型组及给药组较正常组明显升高,差异有统计学意义(F=17.476,P<0.01);在肾功能方面,模型组及给药组血尿素氮较正常组明显升高,差异有统计学意义(F=21.767,P<0.01);模型组、氯沙坦组血肌酐较正常组升高,差异有统计学意义(F =1.676,P<0.05),详见表1。
表1 各组大鼠血糖、肾功能比较Tab.1 Comparison of blood glucose and renal function among four groups of rats
1)肾组织免疫组织化学检测结果:正常组肾小管间质FN表达最少(图1A);模型组肾小管间质FN表达最多(图1B);氯沙坦组FN表达少于模型组(图1C);中药组FN表达少于西药组(图1D)。
2)积分吸光度比较结果:与正常组比较,模型组、氯沙坦组、中药组差异有统计学意义(F=29.947,P<0.01);与模型组比较,氯沙坦组差异有统计学意义(F=29.947,P<0.05),中药组差异有统计学意义(F =29.947,P<0.01);中药组与西药组比较差异有统计学意义(P<0.01),详见表2。
1)肾组织免疫组织化学检测结果:正常组肾小管间质LN表达最少(图2A);模型组肾小管间质LN表达最多(图2B);氯沙坦组LN表达少于模型组(图 2C);中药组LN表达少于西药组(图2D)。
2)积分吸光度比较结果:与正常组比较,模型组、中药组差异均有统计学意义(F=17.691,P<0.01);与模型组比较,西药组、中药组差异均有统计学意义(F=17.691,P<0.01),详见表3。
表2 各组大鼠肾小管间质纤维粘连蛋白积分吸光度比较Tab.2 Comparison of tubulointerstitial fibronectin sumdensity among four groups
表3 各组大鼠肾小管间质层粘连蛋白积分吸光度比较Tab.3 Comparison of tubulointerstitial laminin sumdensity among four groups
1)肾组织免疫组织化学染色结果:正常组肾小管间质Ⅳ型胶原表达最少(图3A);模型组肾小管间质Ⅳ型胶原表达最多(图3B);氯沙坦组Ⅳ型胶原表达少于模型组(图3C);中药组Ⅳ型胶原表达少于西药组(图3D)。
图3 各组大鼠肾小管间质Ⅳ型胶原的表达Fig.3 Tubulointerstitial collagenⅣexpression of each group(400×)A:normal group;B:model group;C:losartan group;D:traditional Chinese medicine group.
2)积分吸光度比较结果:与正常组比较,模型组、西药组差异均有统计学意义(F=5.322,P<0.05,P< 0.01);与模型组比较,中药组差异有统计学意义(F =5.322,P<0.05);中药组与西药组比较差异无统计学意义,详见表4。
表4 各组大鼠肾小管间质Ⅳ型胶原积分吸光度比较Tab.4 Comparison of tubulointerstitial collagenⅣsumdensity among four groups
糖尿病肾病是糖尿病的血管合并症,多隐匿起病,早期不易察觉,而到晚期出现显性蛋白尿时,则已经错过治疗时机。因此诊断和治疗DN宜早不宜晚,应该在肾脏病变处在代偿期时予以干预,延缓其进展到失代偿期。其中,中医药治疗则是有效方法之一[3]。
根据糖尿病肾病本虚标实的病机,以扶正祛邪为治疗法则,应用加味消渴康治疗糖尿病肾病,在临床上取得了一定疗效。本方由生黄芪、山萸肉、生薏米、葛根、决明子、丹参、水蛭组成,具有健脾益肾,祛瘀化浊的功效。本方在生黄芪、山萸肉等健脾益肾药物的基础上加入了水蛭、丹参等活血化瘀药以及决明子、生薏米等利湿化浊药,旨在糖尿病肾病早期祛除瘀血,清利湿浊,更加有利于顾护正气。研究[4]表明,黄芪可以减轻DN大鼠蛋白尿,改善肾功能,并可抑制肾组织LN的表达。山茱萸环烯醚萜总苷能抑制糖尿病大鼠肾皮质糖化终产物的形成,使其受体mRNA表达水平下降,可以减轻DN病变[5]。决明子可以抑制DN大鼠肾组织内核因子-кB的活性,进而延缓DN的进展[6]。丹参能够保护DN大鼠肾功能,并抑制肾组织转化生长因子-β1和Ⅳ型胶原的表达[7]。仝小林等[8]研究显示,水蛭可以改善DM大鼠血液高粘、高凝状态,并能降低DM大鼠的尿微量白蛋白。顾江平等[9]研究显示,水蛭可以降低DN大鼠肾组织内皮素-1的表达,并能降低肾脏指数(肾质量/体质量)。李琳等[10]研究显示,水蛭可以降低DN大鼠血清肌酐、尿素氮水平,并能降低24 h尿微量白蛋白,此外,水蛭还能降低DN大鼠肾组织转化生长因子-β1及基质金属蛋白酶抑制因子-1的表达,上调基质金属蛋白酶-9的表达。
本实验研究结果显示,加味消渴康能够降低DN大鼠肾组织的FN、LN和Ⅳ型胶原的积聚,对防治糖尿病肾病有一定的作用,其具体作用机制还有待于进一步深入研究。
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[9] 顾江平,赵玲,栗德林.水蛭对糖尿病大鼠内皮素-1水平的影响[J].中成药,2007,29(10):1421-1424.
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