大环内酯类抗生素有关物质检测方法研究进展

邓晶晶，唐克慧

(1.成都医学院药学院实验教学中心，四川 成都 610083;2.中国医药集团四川抗菌素工业研究所，四川 成都 610051)

有关物质多指药物中的有机杂质，也包括残留溶剂和手性化合物中无特殊毒性的对映体。其主要来源于药物的制备和贮存过程，如合成过程中的副反应产物，原料中的杂质，纯化和精制操作中带入的杂质，以及因成品贮存条件因素引入的杂质等。药物中含有杂质会降低其疗效和影响其稳定性，甚至对人体健康有害或产生其他副作用。因此，对有关物质进行检测，控制药物纯度，以控制药物质量至关重要。综合大环内酯类抗生素有关物质检查的相关报道，主要是根据吸附或分配性质等的差异采用色谱法对杂质进行测定，如薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相－质谱联用技术(LC－MS)及气相色谱法(GC)等，也有的采用毛细管电泳法(CE)。其中气相色谱法主要用于残留有机溶剂的检测，在此重点阐述TLC法、HPLC法、LC－MS法及CE法等在该类抗生素有关物质检测中的应用，并对其发展前景进行了展望。

1 薄层色谱法

TLC法是一种检测有关物质的经典方法，具有快速、简便、操作简单等特点，尤其适用于检测无紫外吸收的物质。目前，各国药典在采用TLC检测该类抗生素中某一药物的有关物质时，均采用了系列对照溶液进行梯度点样的方法来“半定量”地评估杂质量，并对杂质数目、最大杂质量和总杂质量均有详尽的评判要求。在用TLC检测有关物质时，若分离效果达不到要求，则影响测定的准确性，故应有系统适用性试验检测系统的有效性。余立等[1]在用TLC检测阿奇霉素及其有关物质时，考虑到红霉素既是阿奇霉素的合成前体，又是其主要降解产物，且易于得到，而斑点又和阿奇霉素相邻，因此选择红霉素作为该色谱系统的适用性试验指标物质，并规定阿奇霉素与红霉素主斑点要完全分离，以保证色谱系统的有效性。唐克慧等[2]在用TLC检测克拉霉素注射液中的有关物质时，对克拉霉素注射液采用乙酸乙酯作为萃取溶剂分多次萃取的方法进行前处理，并通过试验证明了该萃取方法的可行性，同时建立的萃取－薄层色谱法较成功地解决了辅料严重干扰克拉霉素注射液中的有关物质检测这一难题。

2 高效液相色谱法

HPLC法具有分离效率高、选择性好、分析速度快、操作自动化和应用范围广的特点，目前是各类药物有关物质检测的主要方法，如杂质对照品法(适用于已知杂质)、主成分自身稀释对照法(适用于一般杂质检查，杂质成分少且尚不能取得其对照品，简称“自身对照法”，分为加校正因子计算和不加校正因子)、归一化法(现已不多用)，第一法为外标法、定量检测，后两法均为限量检测[3]。在对大环内酯类抗生素和利福霉素类抗生素的有关物质检测中，HPLC应用非常广泛。在已见报道的方法中，检测器的选择又以紫外检测器为主，如李战[4]、林玲等[5]、戴玉荣等[6]、杨亚莉等[7]、魏王君等[8]分别采用该方法对大环内酯类抗生素的代表药物进行了有关物质的检测。而根据大环内酯类抗生素的结构特点，所选择的紫外检测器的波长基本都处于低波长位置，但在此位置检测易产生干扰。因此，除紫外检测器外，电化学检测器在该类抗生素的相关物质检测中也有应用。电化学检测器是根据电化学原理和物质的电化学性质进行检测，在液相色谱中，可以检出所有电活性物质。栾杰等[9]和李海英等[10]均采用电化学检测器的高效液相色谱法进行阿奇霉素的有关物质检测，定量检出了阿奇霉素中红霉素过氧化物、阿奇霉素脱氧化物、阿奇霉素杂质A和N脱甲基阿奇霉素等有关物质。经试验发现，该法较之该类药物国内通用的微生物检定法有很大的优越性，具有灵敏度高、线性范围宽、精密度好、专属性强、易于准确定量等优点，大大提高了检测效率和检测速度。

3 高效液相－质谱联用技术

LC－MS联用技术将高分离性能的LC技术与能够获取丰富化学结构信息的MS技术相结合，可直接对微量未知化合物进行结构鉴定。与以紫外检测器为检测手段的HPLC法相比，MS检测技术提供了更快速、有效的未知杂质鉴定，省去了分离与纯化过程，有效节约了时间。Govaerts等[11]采用LC－MSn对琥乙红霉素中的4种未知杂质进行了鉴定。Debremaeker等[12]利用液相色谱－离子阱质谱联用技术成功分离和鉴定出阿奇霉素样品中6个未知的相关物质。因此，充分利用LC－MS技术获得的信息可迅速实现药物有关物质的分离及结构鉴定。

Kumar等[13]在进行红霉素样品的检测鉴定过程中，首先利用MS/MS和MSn技术建立了相关物质谱库，之后再运用液质联用方法将红霉素样品中的相关物质与之前的相关物质谱库中的结果进行对比，从而鉴定出红霉素中的8个未知相关物质。Deubel等[14]将电喷雾离子化多级质谱分析方法用于红霉素A(EA)及其相关物质的测定，利用多反应监测技术(MRM)成功检测了红霉素A及其相关物质，并通过较先进的离子阱系统软件推测得出预期效果之外的2个新的相关物质的结构。结果显示，该方法的准确度、精密度、灵敏度均超过要求，且线性关系良好。Leonard等[15]在检测克拉霉素及其有关物质时采用LC－MSn技术，通过试验对克拉霉素中的1个未知杂质进行了结构确证，并分离检测出另外2个未知杂质。Pendela等[16]在检测螺旋霉素的有关物质时采用了液质联用方法，其液质条件中利用大气压化学离子化源(ACPI)作为接口技术，该技术是一种非常耐用的离子化技术，通常不需特殊优化，容易使用。在该试验条件下，通过对螺旋霉素及其有关物质的碎片离子的分析，共发现17个有关物质，其中3个为欧洲药典中已经报道的特定杂质。

4 毛细管电泳技术

CE也称高效毛细管电泳(HPCE)，是近年发展起来的一种仪器分析方法，可广泛应用于分离、分析有机与无机阴、阳离子，手性分子、中性分子及大分子，以及单细胞。CE是在毛细管分离通道中，在电场作用下，带电质点(离子或胶粒)在电解质溶液中，向电荷相反的电极迁移。在迁移过程中，因带电质点的电荷数量、电荷符号与质点大小的差别，造成迁移速率的不同而达到分离。

在大环内酯类抗生素的有关物质检测中用到了2种毛细管电泳的分离分析技术，分别为毛细管区带电泳(CZE)和毛细管胶束电动色谱(MECC)。前者是通过在充满电解质溶液的开口毛细管中，荷质比不同的组分在电场作用下，电泳淌度不同而被分离的，荷质比大的离子电泳淌度大，先到达检测窗口;反之，则后到达。该方法常作为反相高效液相色谱的补充。Lalloo等[17]通过试验考察，确定了检测红霉素中有关物质的毛细管区带电泳工作条件为150 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.5)－35%乙醇，分离电压30 kV，检测波长200 nm。试验结果显示，该方法可准确用于红霉素和其相关物质(如红霉素C等)的分离和定量分析。而MECC则具有电泳和色谱的两重分离性能。该分析方法是在缓冲液中加入表面活性剂，当表面活性剂的浓度超过临界浓度(CMC)时，则聚结而形成胶束，从而在含有胶束的背景电解质中进行毛细管电泳。在MECC系统中，实际存在着类似于色谱的两相:一相是流动的水相;另一相是起到固定作用的胶束相。样品在这两相之间分配，并由于其在胶束中不同的保留能力而产生差速迁移。Tobback[18]等用胶束电动毛细管色谱法测定了大环内酯类抗生素中泰乐菌素及其相关物质。测定条件为，以80 mmol/L磷酸钠缓冲液(pH=7.5)－20 mmol/L胆酸钠－7 mmol/L溴化十六烷基三甲铵为背景电解质，运行电压18 kV，检测波长205 nm，在该测定条件下泰乐菌素和其相关物质在15 min内能够得到有效分离。

5 结语

综上所述，目前对大环内酯类抗生素有关物质的检测主要还是采用色谱分析方法，而HPLC法又因分离效能高、应用范围广，成为主要检测手段，但HPLC法及液质联用技术并不能够完全替代TLC法。HPLC法多是在反相色谱上对大环内酯类抗生素的有关物质进行检测，TLC法则是在正相色谱上对被测物进行检测。对于大环内酯类抗生素，因该类药物的结构特点，若选择HPLC法，其紫外检测波长均在短波位置，在检测时干扰较多，因此在2010年版《中国药典》中，对该类药物中的阿奇霉素和琥乙红霉素有关物质的检测仍选用TLC法进行。利用液相－质谱的联用技术则可在使用色谱方法对有关物质进行分离的基础上，进一步对有关物质的结构进行推测，更有利于全面掌握有关物质的信息。但必须解决好来自于色谱和质谱两方面的问题，主要包括液相色谱液体流动相的去除，质谱灵敏度、稳定性的提高和质谱体积、成本的降低。CE法是目前研究较多的色谱新方法，该法没有HPLC法中存在的传质阻抗、涡流扩散等降低柱效的因素，纵向扩散也因毛细管壁双电层的存在而受到抑制，因而能达到很高的理论板数及极好的分离效果，在经济性、实用性等方面显示了巨大的优势。目前，将CE的高分辨率与质谱的高灵敏度相结合的最新联用技术已得到初步发展，该仪器具有高柱效、高分辨率、高灵敏度及分析速度快的显著特点。但由于质谱仪接口的限制，在气相色谱－毛细管电泳法联用时，只能用含有挥发性缓冲盐的背景电解质，对气相色谱法的分离效果有一定限制，因此成为目前此联用技术亟待解决的问题。

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