脑缺血耐受中线粒体及细胞色素C的作用

苏 静 姜长斌 尹 剑 刘 琳 (大连医科大学附属第二医院癫痫门诊，辽宁 大连 116027)

脑动脉自然闭塞或由于治疗疾病原因而人为闭塞可能会造成脑缺血损害，其发展取决于很多病理生理机制的内在联系，例如神经递质的释放、膜离子成分的崩溃、线粒体功能障碍、凋亡机制的触发、反应性氧的产生、炎性细胞的释放、血脑屏障的破坏、微循环灌注的障碍及很多其他因素〔1～4〕。这些反应可以被多种神经保护机制抵消。研究表明，短暂缺血可启动机体自身保护机制，提高组织缺血、缺氧的耐受性，此现象称为缺血预处理或预处理(IPC)的保护作用。1986年IPC作为心血管保护的辩论形式由Murry首次提出，认为短暂的缺血损伤能保护心肌避免发生后续的致死性坏死。目前IPC的研究以心、脑报道最多。脑缺血预处理或神经缺血预处理(NIPC)是由多种低于永久性损害刺激形成的机体内在的神经保护措施，能使神经系统增加抵抗致死性缺血性损害的能力，不易形成永久性缺血损害〔1〕。虽然缺血预处理的脑保护作用得到广泛的认可，但其发生的机制以及如何最大可能地开发和利用这种内源性脑保护机制，使缺血性脑损害降至最低程度，仍然是一个待解的课题。

1 脑缺血预处理(BIP)和脑缺血耐受现象

BIP是指通过亚致死性的短暂脑缺血过程，诱导脑组织产生内源性保护机制，使之在一定程度上耐受或减轻再次发生的脑缺血损伤。其所诱导的耐受叫做脑缺血耐受(BIT)〔5〕，表现为实质细胞死亡明显减少、梗死范围大幅度缩小、器官功能障碍明显减轻等。1987年，Tomida在心脏中观察到IPC现象，并对此作了详细描述。随后，在哺乳动物的大多数器官(脑、脊髓、骨骼肌、肺、肾、小肠等)中都发现了这一有趣的现象。1990年，日本学者Kitagawa采用沙土鼠前脑缺血模型首先发现海马缺血耐受现象。近年来对BIP机制进行了广泛研究，越来越多的资料表明:BIP是一个涉及介质、受体、基因表达等多环节调控的复杂生物学过程〔6，7〕。

1.1 IPC保护作用的形成机制 NIPC保护作用实际上是短暂缺血启动机体内源性保护机制，提高神经元、组织对缺血的耐受能力。从整体上看，NIPC改善了脑血流量，由于短暂脑缺血，导致脑侧支循环形成，脑血流量增加，延缓脑细胞坏死，在脑血管完全梗死时加以代偿。机体在受到刺激损伤时，释放出大量内源性物质，并通过一定的调控机制在不同时间、不同浓度、不同地方表现出不同作用，可能是损伤，也可能是保护作用。

从细胞防御机制看，炎性细胞(包括淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等)、内皮细胞及相应缺血组织、脏器实质细胞均介导了损伤过程;从分子水平看，大量的代谢产物(如腺苷、自由基等)、递质、受体及新合成或分泌产物(如细胞因子等)等在不同时间、不同程度介导损伤。蛋白质的基因也出现相应改变，调控着机体病理生理改变(如即刻早期反应基因、抑凋亡基因、促凋亡基因等)。研究表明〔4〕，上述各种损伤因子均在一定程度、一定时间表现出抗损伤作用。因此，如何调控好损伤和抗损伤的关系，使机体朝着有利的方向发展，将是最终解决缺血、缺氧损伤的重要手段。

1.2 NIPC的时间过程 IPC作用对如何选择合适的缺血间期至关重要，多数实验表明，IPC神经保护作用存在快速相、延迟相两个阶段。第一阶段的保护作用在IPC后数分钟即可表现出来，称作“经典”的IPC保护效应，有效期短暂，1～2 h之后消失。形成机制是由翻译后修饰中介的独立的蛋白合成所引起。该阶段的研究以循环系统最为深入，而对中枢神经系统则争议甚大，认为IPC后早期对再次脑缺血不表现出保护作用。脑内同样存在IPC的快速相保护作用，大鼠在接受10 min缺血性损害前30 min接受2 min的IPC比单纯接受10 min缺血性损害能显示出更强的神经保护作用，引起了人们的关注。IPC是由于适应缺血应激反应的流动媒介机制或细胞代谢机制引发的〔3〕。第二阶段也称为IPC保护作用的“第二窗口”(the second window)，由IPC应激引发形成迟发保护。有学者认为“第二窗口”的保护作用出现在IPC后大约72 h，2 w内逐渐消退。然而也有不同看法，Kato等报道IPC后24 h即可表现出显著的脑保护作用，并可持续到IPC后5～7 d。其形成机制可能有基因复制和蛋白合成引起〔8〕。由于第二阶段的保护作用持续时间较为固定，与临床有潜在的关系，最近的研究重点多集中在IPC的迟发相上〔9〕。现在公认迟发相NIPC是一个由IPC刺激引发表型改变的一套多级过程和其他机制介导的保护因素〔4〕。快速相和延迟相的NIPC是不同的，在体内，快速相NIPC似乎只能提供短暂的神经保护作用，延缓了神经死亡的时间过程，而不能保证长期的神经元生存。

1.3 NIPC与短暂性脑缺血发作(TIA) TIA很久以来被认为是脑梗死的重要危险因素。近年实验证实，一次短暂的亚致死性脑缺血可对脑细胞起到保护作用，使再次脑缺血时脑组织的病变比单次脑缺血时轻。临床证据也显示，病人在脑梗死之前若经历过同侧的TIA发作，较那些没有发生过TIA的患者恢复情况要好〔10〕。TIA作为IPC刺激能引发神经保护，改善脑卒中的预后〔10〕。区别TIA的危险和保护作用是困难的，因为TIA是一类脑血管疾病的临床诊断，其持续时间、位置、严重性和次数均有不同〔11〕。多元回归分析中预后差别的唯一参数是前驱TIA发作，因此，TIA对病人和临床医生是一个潜在血管疾病警示，可以运用可能的临床装置—体外模型IPC信号传感器，来指导神经保护治疗和预判脑组织缺血耐受性的自然发生情况，从而减少闭塞血管之后脑卒中发生的可能性。

另一方面，当频繁TIA发生，时间间隔很短，则可能遮蔽了以前引发的脑保护作用，造成严重缺血。如果把前驱TIA作为小面积或不严重缺血的IPC，有前驱TIA病人的灌注缺陷应该不同于无TIA发作的病人。而事实上，在有前驱TIA发作的病人和无TIA发作的病人中，灌注损害的大小和脑血流量(CBF)及脑血容量(CBV)没有差别，显示两组病人血流限制、微血管功能紊乱程度和严重性相同，然而，有前驱TIA发作病人的梗死面积更小〔12〕。轻微的整个IPC损害，显著地减少了永久性大脑中动脉闭塞(PMCAO)的梗死面积，解释这种现象只能考虑有脑缺血预处理的机制作用。

2 脑缺血耐受中的凋亡机制

目前比较普遍的认为，在脑缺血神经细胞损伤过程中，在缺血发生迅速且程度较重的中心区域常发生坏死，而正常脑组织与坏死脑组织之间半暗带区的细胞表现为凋亡。凋亡的发生既是凋亡相关基因表达的结果，又受内外因素的调节，它的转归可直接影响梗死灶的范围，因此保护这部分细胞对脑缺血的治疗具有重要的意义。脑缺血预处理可以通过抑制细胞凋亡来减轻脑缺血缺氧损伤。

2.1 细胞凋亡的基本概念 “细胞凋亡(apoptosis)”是“程序性细胞死亡(programmed cell death)”的一种形式，是一种生理性、主动性的细胞“自杀行为”。细胞程序化死亡最早是由Lockshin和Wiliams在1965年提出。随后在1972年，Kerr等描述一种在形态学上和坏死完全不同的细胞死亡类型，并称之为凋亡(apoptosis)。其形态学特点如下:①细胞和胞核皱缩，体积缩小。②核染色质浓缩，凝集至核膜周边，呈月芽形斑块状。③细胞器结构不受损害。④细胞膜内陷将整个细胞分割成数个大小不等的不连续小体，内有部分细胞器，有或没有核碎片，称为凋亡小体。⑤凋亡小体被吞噬细胞吞噬，不引起炎症反应。

细胞凋亡最显著的生化特征是Ca2+、Mg2+依赖的内源性核酸酶的激活将核染色体从核小体间断裂，形成由大约为180～200 kb低聚核小体片段，琼脂糖凝胶电泳可见特征性的“梯状”(ladder)带，此特征被认为是鉴别细胞凋亡的一个试金石。细胞凋亡是机体在生长、发育和受到外来刺激时清除多余、衰老和受损伤的细胞以保持机体内环境平衡和维持正常生理活动过程的一种自我调节机制。这种调节机制的异常与多种疾病的发生有关，如癌症的发生与细胞凋亡的抑制有关，而老年性痴呆、缺血性卒中等均与凋亡有关。目前对细胞凋亡的研究已经涉及肿瘤生物学、发育生物学、神经生物学、免疫生物学等方面，已经取得很多突破性的成果。

单细胞个体无凋亡现象，而多细胞生物多数有凋亡现象。凋亡可自发产生，但多数情况下需特殊介导物或条件诱导产生。已发现能诱导细胞凋亡的介导物有三类:①激素及生长因子;②免疫细胞;③毒素、损伤、射线、高温、某些化学物质等理化因素及生物因素。

细胞凋亡作为一个独特的细胞死亡过程，表现许多独特的细胞现象。在生化水平，凋亡过程中，细胞发生一系列的基因表达及蛋白合成。目前，发现许多相关的基因影响细胞凋亡，在神经系统，现已知与凋亡相关的基因基本上分为两大类:一类是促进细胞凋亡的基因，如bax、bcl－xs等，另一类是抑制细胞凋亡的基因，如bcl－2、bcl－xl等。凋亡基因和抗凋亡基因之存在综合平衡，平衡失调可启动一系列生物事件的连锁反应，进而改变细胞对凋亡的抵抗力〔13〕。

2.2 线粒体与细胞凋亡 近年来，人们对细胞凋亡的认识逐渐深入，对细胞凋亡发生机制的了解越来越透彻，在细胞凋亡的调控等方面都取得了显著的进展。尤其是对线粒体在细胞凋亡过程中重要作用的发现，更是引人注目，有人提出:线粒体在细胞凋亡中起决定性的作用〔14〕。

2.2.1 线粒体的功能 自1850年发现线粒体、1898年命名、1963年发现线粒体DNA(mDNA)后，人们又在线粒体中发现了RNA、DNA聚合酶、tRNA、核糖体、氨基酸活化酶等进行 DNA复制、转录、蛋白质翻译的全套装备，表明线粒体具有独立的遗传体系。虽然线粒体也能合成蛋白质，但是合成能力有限，线粒体中绝大部分蛋白质都是核基因编码，在细胞质中合成后，定向转运到线粒体的，因此线粒体是一种半自主性细胞器。真核细胞的线粒体是重要细胞器，是动物细胞生成ATP的主要场所。线粒体基质的三羧酸循环酶系通过底物脱氢氧化生成NADH，NADH通过线粒体内膜呼吸链氧化。与此同时，导致跨膜质子移位形成跨膜质子梯度和(或)跨膜电位。线粒体内膜上的ATP合成酶利用跨膜质子梯度能量合成ATP。合成的ATP通过线粒体内膜ADP/ATP载体与细胞质中ADP交换进入细胞质，参与细胞的各种需能过程。

2.2.2 线粒体与细胞凋亡 线粒体是细胞的能量工厂，是真核细胞生存的基础。越来越多的实验证据表明，线粒体是细胞凋亡调控的活动中心。线粒体在细胞凋亡中的作用主要表现为〔15〕:①在凋亡发生过程中，多种促进细胞凋亡的蛋白转移至线粒体，从而使线粒体膜的通透性和完整性受到破坏。由于内膜对氢离子的通透性增加引起线粒体膜电位消失;Bcl－2家族蛋白主要通过调节线粒体的功能来调控细胞的凋亡;②有多种凋亡诱导因子从线粒体释放，如细胞色素C、AIF、Smac/Diablo和 Caspase 前体蛋白 procaspase－2，－3，－8 和－9 等在凋亡发生过程中从线粒体膜间隙被释放到细胞质中，随后引起典型的凋亡变化;③有一些凋亡诱导物能够诱导线粒体上的膜通透性转变孔(PTP)开放，导致线粒体膜电位消失和释放促凋亡蛋白。

2.3 线粒体通透性转换与细胞凋亡

2.3.1 线粒体通透性转换孔 线粒通透性转运孔(MPTP)是一种跨膜多蛋白孔，其分子组成尚未完全清楚，目前认为它是一个横跨于线粒体外膜和内膜之间的蛋白复合体。主要由位于线粒体外膜的孔蛋白，即电压依赖的阴离子通道(VDAC)、内膜的腺苷酸移位酶(ANT)、和基质的亲环蛋白D(CyD)组成三联复合物。其功能受多种蛋白质调节，如膜间隙的肌酸肌酶，外膜的己糖激酶等。生理状态的MPTP能通过小于1500 kD分子量的非特异性物质，并允许质子自由通过线粒体内膜，从而在线粒体内外造成电势差，形成稳定的膜电位，推动了线粒体ATP的合成。

2.3.2 线粒体通透性转换与细胞凋亡 在受到特定刺激时(如钙离子)，MPTP开放，直径达2.0～2.6 nm，造成离子和一些凋亡活性物质释放，线粒体内外电荷分布紊乱，线粒体膜除极化，导致膜电位下降，ATP生成减少，影响了呼吸链正常运转。同时，基质内的吡啶核苷酸(PN)外流致使氧化代谢减弱，氧呼吸降低〔16〕。线粒体呼吸功能紊乱，组成线粒体抗氧化防御系统的PN－还原型烟酰胺二核苷酸(NAD(P)H)流失，都易使线粒体产生大量的活性氧自由基(ROS)。Ca2+也会从基质通过MPTP释放到线粒体外。由于线粒体基质蛋白含量高，胶体渗透压大，而内膜通透性增加，使得水分子大量进入线粒体基质，离子的流动还可能造成线粒体基质的晶体渗透压增高，从而使线粒体膨胀，内膜去折叠。由于内膜面积远大于外膜，从而导致线粒体外膜破裂，使位于膜间隙的细胞色素C释放。释放出的细胞色素C则可能启动casepase通路，导致细胞凋亡。脑缺血缺氧会引起线粒体通透性转换(MPT)，从而导致细胞色素C释放，进而激活凋亡程序。

3 细胞色素C与细胞凋亡

3.1 细胞色素C的释放 线粒体是调控细胞凋亡的中心，细胞色素C是第一种被发现的线粒体释放的促凋亡因子，细胞色素C释放是线粒体凋亡途径的标志性事件。细胞色素C是水溶性的小分子物质，分子量14.5 kU，核编码的蛋白质，是位于线粒体呼吸链复合物Ⅲ和Ⅳ之间的基本组成部分，在传递电子和ATP生成过程中起重要作用。

生理情况下，线粒体内膜对物质通透具有高度选择性，细胞色素C很难从内膜进入胞质。关于细胞色素C释放的机制，目前有不同的假说，但尚无定论。第一种是Bax依赖的线粒体外膜通透模型。鉴于Bax和Bak等在细胞色素C释放中的不可或缺的作用，Bax可以在线粒体膜上形成多聚体并形成大通道使细胞色素C等促凋亡物质从线粒体内外膜之间释放。也有人提出，Bax和Bak等正常情况不能与抑凋亡蛋白分子Bcl－2/Bcl－xL/Mcl－l相互结合。而仅含 BH3 结构域的 Bcl－2 家族促凋亡蛋 白 tBid、Bim 等能与 Bcl－2/Bcl－Xl/Mcl－l 相互 作用，使Bax/Bak等从抑凋亡蛋白游离，进而形成多聚体，促使线粒体膜通透，导致细胞色素C释放。Shimizu等〔17〕认为Bax或Bak与VDAC结合后，可以调节线粒体的膜电位，并导致细胞色素C从Bax/Bak和VDAC共同形成的大通道释放，该小组应用电生理方法检测记录到了这样一个大通道的存在。目前有研究发现细胞凋亡时，Bax从胞浆转移到线粒体上，促使细胞色素C释放。同时发现Bax的62位半胱氨酸是其转位所必需的，而126位半胱氨酸对其转位没有作用〔18〕。也有研究报道发现Bid/tBid也可以在人工脂质体或平面上形成通道，Bid/tBid形成的通道有可能参与Bid/tBid诱导的线粒体释放细胞色素C的过程〔19〕。尽管如此，还有报道在Bax/Bak缺失的细胞中，棉酚仍能诱导细胞色素C释放，很可能是通过诱导Bcl－2构象变化来促进线粒体细胞色素C释放。这说明Bax和Bak对线粒体细胞色素C释放不是绝对必需的。第二种模型认为，PTP参与的外膜破裂，PTP开放使线粒体肿胀，外膜破裂，引起内外膜间细胞色素C释放。

3.2 细胞色素C启动的细胞凋亡 最近的研究表明，活化的Casepase－3可以反过来作用于线粒体，引发线粒体细胞色素C的释放，细胞色素C经级联反应又可以激活Casepase－3，构成细胞色素C释放的正反馈调节机制〔20〕。有发现线粒体复合物Ⅲ的一个亚基能够被活化的Casepase－3特异性切割介导细胞色素C的释放。线粒体细胞色素C释放会促进相应的Casepase激活，同时激活的Casepase直接攻击线粒体，进一步引发更多的促凋亡因子从线粒体释放，从而形成凋亡信号的正反馈。线粒体在这里成为细胞凋亡信号的放大器。在凋亡早期只有少量的细胞色素C的释放，线粒体保持氧化磷酸化功能，提供凋亡需要的能量;一旦Casepase激活后反馈攻击线粒体从而导致更多的线粒体细胞色素C释放到胞质中，导致凋亡信号放大，细胞线粒体功能丧失和细胞死亡。

caspase家族是一大类凋亡调节基因，已发现14种caspase蛋白，其中ccaspase－3是caspase级联“瀑布”下游最关键的凋亡执行蛋白酶。在正常情况下，caspase－3以无活性的酶原形式存在于哺乳动物的多种组织和细胞内，其在免疫细胞、脑和胚胎起源的细胞中有高水平表达。凋亡是蛋白酶级联切割的过程，不同的蛋白酶在凋亡的不同阶段发挥功能。根据caspase在级联反应中的作用位置，分为始动caspase及效应caspase，其中caspase－3为效应caspase，且处于核心位置，发挥非常重要的作用。不同的蛋白酶切割caspase－3酶原，激活caspase－3，活化的caspase－3进一步又切割不同的底物，导致蛋白酶级联切割放大，最终使细胞走向凋亡。因此caspase－3被称为死亡蛋白酶。

可见细胞色素 C释放后激活 Casepase－9，而且 casepase－9处在casepase级联的顶端〔21〕，启动casepase的级联反应，活化Caspase在细胞中能够切割400多种底物，如Lamins、信号分子如蛋白激酶、骨架蛋白、DNA修复酶以及包括调控mRNA剪切、DNA复制的功能蛋白。这些重要蛋白质的降解和核酸酶的激活最终导致细胞凋亡〔22〕。因此CytC起始的casepase－9线粒体途径在凋亡过程中起了关键性作用。

4 总结

虽然IPC的病理生理学过程及其生化机制目前尚不十分清楚，但是IPC的效应提示脑组织具有自身保护机制。线粒体在凋亡信号转导通路中的重要作用正在不断被认识，最近研究提示膜受体和内质网通路的信号最终都汇聚在线粒体通路中，转移到线粒体膜将凋亡信号传递至线粒体，促进CytC释放，引起凋亡，而细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤〔23〕。故可以设想MPT及CytC在细胞凋亡过程中起了“上游始动或开关”的作用。通过研究脑缺血预处理后线粒体通透性转换孔及细胞色素C变化，有望发现脑缺血预处理抑制凋亡的作用位点及作用机制，可以指导找到可外在干预的靶点，为临床防治缺血性脑血管病提供新的有效途径，延长缺血性卒中的治疗时间窗，减轻其临床后遗症，为研发防治缺血性脑血管病药物提供理论基础。

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