网络药理学实验研究相关技术

程肖蕊，周文霞，张永祥

(军事医学科学院毒物药物研究所中药和神经免疫药理研究室，北京 100850)

网络药理学(Network pharmacology)是从系统生物学和生物网络平衡的角度阐释疾病的发生发展过程、从改善或恢复生物网络平衡的整体观角度认识药物与机体的相互作用并指导新药发现。因此，它是在高通量组学数据分析、计算机模拟计算及网络数据库检索的基础上，进行生物网络的构建及分析，进而进行药物作用机制的研究及创新药物的发现［1－2］。目前，网络药理学一方面受限于现有实验数据和数据库的完整性和准确性［3］，另一方面很难对基于网络所建立的预测模型(如靶点组合、通路组合、子网组合、药物组合或多靶点药物等)进行验证或鉴定，因此，网络药理学的发展依赖于实验新技术新方法的发展和突破。

网络药理学的研究思路通常可分为2类:一是根据公共数据库和公开发表的已有数据，建立特定药物作用机制网络预测模型，预测药物作用靶点/机制，从生物网络平衡的角度解析药物作用的药理学机制。如有研究者在阐释抗糖尿病中药复方糖敏灵作用机制的基础上，采用虚拟筛选和网络预测的手段对Rheidin A、Rheidin C、番泻苷C(sennoside C)、原花青素C1(procyanidin C1)和二氢哈尔满(Dihydrobaicalin)这几种从未报导过具有抗2型糖尿病作用的成分进行预测就采用了上述思路［4］;同样对麻黄汤(herba ephedrae decoction，HED)新药理作用进行的预测［5］也采用了上述思路。二是利用各种组学技术以及高内涵/高通量技术，观察药物对模型(分子、细胞、组织或/和动物)的作用或模型对药物的作用，针对所产生的大量数据，采用生物信息学的手段分析和构建药物-靶点-疾病网络，建立预测模型，进而解析所研究药物的网络药理学机制。当然，这两个思路也可并行发展、综合分析，如有些对丹酚酸B治疗心血管疾病的作用进行系统研究即采用了此思路［6］。网络药理学研究中与实验相关的环节有两个:一是基于实验结果构建网络所需基本数据的获取，另一个是对所建立的网络预测模型进行实验验证，这两个环节涉及的技术均应具有可高通量、定量、快速、灵敏、简便、可靠地获取大量数据的特点，这样才能满足网络药理学建立在海量数据基础上的研究要求。综合近年来生命科学研究领域技术方法的进展，目前网络药理学研究在实验研究水平所涉及的相关技术除了组学(基因组、蛋白质组、代谢组和糖组等)技术外，主要包括3个方面:高通量/高内涵技术、双高通量基因表达检测技术和分子相互作用技术。

1 高通量/高内涵技术

高通量(high though-put assay，HTS)/高内涵技术(high content assay，HCS)是指在保持细胞、组织或整体动物结构和功能完整性的前提下，一次性检测成百上千个处理且同时检测被筛样品对活细胞、组织或整体动物多个表型的作用，如形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导各个环节等。其特点是可在单一实验中获取大量相关信息，可应用高分辨率的荧光数码影像系统和后续的自动数字图像分析、处理、储存技术进行高度整合，具有均质、多维表型检测、实时动态监测和可视化的特点。因此，这种具有多维表型检测的HTS/HCS技术［7－9］适合网络药理学研究需要海量、准确数据的要求。

1.1 基于细胞的高通量/高内涵技术

高通量/高内涵技术在细胞模型上是应用最为成熟的，它通过自动显微摄影和图像自动分析，全景式准确、快速、目标导向性的定量检测细胞包括复杂的解剖学结构和生化特性在内的各种表型。如其应用于神经科学可定量树突的各个指标、蛋白聚集、转录因子转位、神经递质受体内化、神经元和突触数量、细胞迁移和分化及凋亡等。这种在细胞模型上的高通量/高内涵技术结合组学技术所产生的结果，可为网络药理学研究中网络的构建提供无偏、准确的基本数据，并对网络结构中基序(motif)和功能模块(module)的确定提供信息。

在基于细胞模型的高通量/高内涵技术中应用最为广泛的是报告基因技术。它使连接有靶基因的报告基因能在细胞中表达，并能通过报告基因的表达变化反映靶基因表达的激活或抑制。目前主要使用的报告基因为外源性荧光蛋白或荧光素酶，通过荧光或发光的方法检测报告基因编码的蛋白质产物变化，可灵敏地反映细胞内某种特定生化或信号转导通路的改变等。例如，对防治阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的重要靶点γ-分泌酶活性研究即可采用该方法［10］。γ-分泌酶裂解淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)胞内段产生 β － 淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)、Notch和其他细胞底物，研究中可将膜结合的荧光探针绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)(即报告基因)连接在γ-分泌酶的底物APP或APP的C99片段上，使APP-GFP/APP-C99-GFP在细胞中表达，若γ-分泌酶有活性时就切割带有标签的底物，荧光从质膜转向胞质，那么利用高内涵仪器检测质膜与胞质荧光强度的比值即可检测细胞γ-分泌酶的活性，也可将细胞通透洗去胞质中荧光后，使用流式细胞仪检测质膜荧光的剩余量而评价γ-分泌酶活性，进而可用于筛选和评价 γ-分泌酶调节剂［11］。

此外，目前不依赖于报告基因技术，而基于免疫荧光技术的高通量、全景式检测细胞表型的高内涵技术也得到了长足的发展和应用。如在培养的大鼠原代皮层细胞，可同时使用微管蛋白(tubulin)一抗配合FITC标记的二抗对神经元进行绿色标记、GFAP一抗配合TRITC标记的二抗对胶质细胞进行红色标记、以及Hoechst对细胞核进行蓝色标记，采用高内涵技术分别对标记神经元、胶质细胞、细胞核的荧光强度进行检测，观察Aβ42对神经突外向生长的影响。结果表明，Aβ42300 nmol·L－1～30 μmol·L－1的可显著减少神经突外向生长，但却不减少神经元的数目。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受体拮抗剂美金刚和烟碱乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)选择性激动剂PNU-282987可减弱Aβ42缩减神经突外向生长的作用。α7 nAChR拮抗剂甲基牛扁亭碱(methyllycaconitine)可显著防止Aβ42导致的突起生长减少。这种基于细胞能同时全景式(或整板全孔)检测多个表型的高内涵分析技术在评价神经保护药物方面具有明显优势［12］。比如，有研究者通过构建过表达四重复Tau蛋白(4 repeat tau，4R0N)的H4神经胶质瘤细胞系，以总Tau和12E8Tau(pS262和pS356)为表型指标，可进行高内涵siRNA筛选，也可高内涵评价激酶对Tau蛋白磷酸化的作用。利用该体系以磷酸化Tau抗体12E8配合Cy5标记的二抗对磷酸化tau进行标记、以Tau抗体配合FITC标记的二抗对总Tau进行标记、使用Hoechst对核进行标记，使用高内涵技术检测红色、绿色和蓝色荧光强度，对572个激酶对Tau蛋白磷酸化的作用进行了评价，结果发现了3个激酶即EIF2AK2，DYRK1A和AKAP13具有磷酸化12E8Tau的作用［13］。另外，又如使用PC12细胞和原代培养的小脑颗粒细胞进行神经突外向生长和药物对神经突生长作用的高内涵评价［14］;使用自动化细胞培养和高内涵图像技术研究高通量shRNA对神经细胞模型SH-SY5Y细胞系的作用［15］。在神经元，使用高内涵图像分析可监测啮齿类皮层混合原代培养神经元神经突触生长以及药物对其影响的情况［16］，并可使用高内涵检测和神经突图像定量软件分析Aβ对小鼠皮层神经元神经突生长的影响，筛选抑制神经突丢失的药物［17］。

1.2 基于组织的高通量/高内涵技术

在组织水平建立高通量/高内涵技术，可观察到复杂的多细胞相互作用及其表型，则更接近生物体本身的情形，为网络药理学研究中定位或预测特定表型的功能子网或模块(module)的基本数据获取提供了手段。

1.2.1 数字切片扫描技术

数字切片扫描技术是一种现代数字系统与传统光学显微镜有机结合的技术，它将传统的玻璃病理切片通过全自动显微镜扫描采集得到高分辨数字图像，再应用计算机对得到的图像自动进行高精度、多视野、无缝隙拼接和处理，以获得优质的整片及其整片可视化数据。数字切片系统主要由自动扫描显微镜系统、图像采集(数码摄像头)系统、自动图像扫描采集控制软件、数字切片浏览器、图像处理软件和计算机、自动上片系统等组成。这种高通量/高内涵的获取和定量分析整片(无偏)组织病理图像技术，不但对于疾病的基本病理生理学和疾病进程的研究具有重要应用价值，而且可为网络药理学的研究快速提供准确数据。目前主要有3种扫描技术，即线性扫描(line scanning)、逐行扫描(progressive scanning)和光矩阵扫描(optical matrix scanning)。

线性扫描技术的核心是时间延迟积分(time delay integration，TDI)线性扫描，在40×模式分辨率可达到0.23μm/像素，且具备红、绿、蓝三基色通道，可以实现扫描样本的原色恢复。使用该技术的目前主要有Aperio ScanScope®CS、Aperio ScanScope®XT、Hamamatsu C9600 NanoZoomerTM等系统。如使用NanoZoomer系统可一次将210张组织切片装载在切片盒中，数字切片扫描系统可自动上载切片，以20×或40×扫描，整片定量分析石蜡包埋和冰冻切片以及涂片特定指标(如Aβ斑块)的免疫组化(明场)或免疫荧光(多色荧光)结果［18－20］。获得的数字切片可用于本地和远程分析/诊断。采用上述系统在8 h内可获取32张染色的AD病人脑切片图片并分析出可靠结果，22 h内可获取100张APP/PS1双转基因小鼠的脑组织切片并分析出可靠结果，能够准确区分AD和非AD患者［21］。使用Aperio ScanScope系统不但能够定量评估病毒导致的淋巴细胞浸润、小胶质细胞激活和神经退化［22］，而且通过对45例AD病人的脑切片研究表明，脑萎缩的速率不是由灰质中的不溶性Aβ量来决定的，脑萎缩/脑室扩大的速率与总Aβ、可见Aβ增加速率无关，而与年龄、Braak神经原纤维缠结阶段、认知变化紧密相关［23］。

逐行扫描是指每一帧图像均是由电子束自左到右、并沿垂直方向自上到下以均匀速度依次一行紧接一行连续扫描而成。15 mm×15 mm的切片可扫描获得800帧图片，图片分辨率为1280×1024像素。使用该技术的目前主要有Nikon Coolscope，Olympus dotSlide，Zeiss MIRAX Scan，Zeiss MIRAX Midi和Zeiss MIRAX Desk等系统。研究表明，使用逐行扫描技术的Zeiss MiraxScan系统的准确率、敏感性、分辨率与传统切片相同，但其却具有整片性、存贮方便、可远程分析和诊断的优点［24］。使用Zeiss MiraxScan系统建立了包括普通绒毛猴(Callithrix jacchus)、恒河猴(rhesus monkey)、日本猴(Japanese monkey)在内的猴脊索的数字切片库［25］。同样使用逐行扫描技术的Nikon Coolscope系统已被用于对肺癌的远程诊断［268］以及对丙戊酸导致前列腺癌细胞系核结构变化的研究［27］。

光矩阵扫描技术使用微型透镜阵列和传感器阵列进行区域扫描，其分辨率为0.5μm。使用该技术的目前主要有DMetrix DX-40系统，该系统已被应用于乳腺癌和乳腺增生病理切片的远程诊断、教学和学术交流中［28］。

1.2.2 高通量神经电生理记录技术

包括有多个微电极(刺激电极和记录电极)阵列技术的神经电生理记录系统可以无创无标记的在组织上进行多通道神经电生理信号采集和记录，其高通量特性适于药物处理后急性分离脑片、药物处理培养脑片的诱发性活动(场兴奋性突触后电位)、自发性活动(尖峰波形信号)、突触可塑性(长时程增强和长时程抑制)等的研究，也适于网络药理学研究中基于网络的预测模型的验证研究。目前，该类技术报道较多的有两种，分别为MED64平面微电极阵列系统(Alpha Med Science，Japan)和多电极阵列 (multielectrode arrays，MEA)系统(MultiChannelSystems，Germany)。

MED64平面微电极阵列技术采用铂黑微电极阵列，可同时获取64个位点的电生理信号，而且所有电极既可用作记录电极，也可用作刺激电极。使用该技术在急性分离的海马片上研究表明，NMDA受体的NR2亚基可能是皮层网络产生的关键，在癫痫发作过程中可导致募集更大范围的震荡［29］。将大鼠海马脑片培养在该系统的多电极微阵列上进行电生理信号的采集和记录，发现重复的长时程抑制诱发刺激能够促使培养的海马脑片突触前和突触后结构的分离，突触的消除伴随着海马神经元功能可塑性的变化［30］。

多电极阵列系统至少含有直径为30μm用硝酸纤维素包被的60根氮化钛电极，以8×8的阵列进行排列。可同时使用4个放大器，采集卡能够同时处理多达128通道的信号。使用该技术在海马脑片上可检测神经突退化的两个阶段即神经突快速肿胀阶段(比对照高的电阻并紧跟一个较慢的崩溃相)和片段化阶段(比对照低的电阻)以监测神经轴突退化情况，评价Tau蛋白磷酸化对神经元的损害［31］。

1.3 基于模式生物的高通量/高内涵技术

基于模式生物(如果蝇、线虫、爪蟾和斑马鱼等)的高通量/高内涵技术，不但可在整体生物体生理环境下研究生长、发育和疾病的机制，筛选和评价药物，而且可从网络的构建、网络结构拓扑学和功能拓扑学的分析到网络预测模型的建立等各个层面上揭示药物的网络药理学作用原理。目前研究较多的有线虫(Caenorhabditis elegans)和斑马鱼。

1.3.1 线虫

线虫是细胞定数动物，神经系统仅有302个细胞，约占整个动物体细胞总数的三分之一。胚胎平均大小为50μm，成虫为1 mm长、30μm宽，虫体透明。线虫神经系统含有高等动物脑的大多数分子成分，身体其余系统亦含有类似人类的多个分子成分，可用于网络药理学的研究。如利用线虫建立机械刺激学习模型、温度趋向性模型、有害刺激学习模型和NaCl物质学习模型，采用高内涵技术检测药物对其行为学的作用，观察神经元发育及神经极性的变化等。

Albrecht等［32］建立了一种可允许线虫自主爬行的微流控制系统，可对线虫的行为进行高内涵分析。该微流装置2 cm×2 cm，布满直径为200μm的圆柱形突起，两突起中心距离300μm，液体在突起间流动。上下游有障碍以限制线虫的活动区域，具有刺激输入口和输出口以及虫体入口。有时间脉冲、空间分布和线性浓度梯度3种刺激模式。这些刺激均通过水相传递，从而消除了气-液转换导致的控制差异。每个刺激模式都有3个参数:转向动力学、进入气味带的方向以及速度(可通过气味调节)。该装置可同时测试4种刺激和4个独立的虫群。利用该装置通过定量分析几十种行为参数，已定义了野生型线虫和感知突变型线虫预期的和非预期的反应。这种基于线虫的高通量/高内涵技术的建立，可进行行为学、光遗传学、钙成像分析或进行高通量药物筛选等，并可应用于神经环路的功能及其遗传和分子机制的研究。

使用脂滴特异性染料Bodipy 493/503对脂肪染色并采用流式细胞术结合显微镜观察的方法对线虫的代谢进行研究，结果表明，Bodipy对固定的和活的线虫染色均能看见主要脂肪存贮、天然脂滴形态，并可定量分析每个虫体所含的脂肪量。饮食限制、转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)和种系突变可表现出各自特异的脂肪/虫体积比率。这种方法能够敏感、准确和高通量的在单个线虫水平评估大群体线虫的肥胖情况［33］。

基因谱的高内涵筛选往往限于单个细胞，Green等［34］建立了一种基于多细胞生物复杂组织结构的分析方法。他们通过对线虫性腺组织结构成像，获得了554个线虫必需基因，可分为94个表型。为了寻求网络构建的评价标准，将这554个基因分成102个表型组，用于预测不同细胞生理途径的基因的功能。进而基于基因间连接重要性的分级，建立了利用高内涵数据谱构建基因网络的稳定的计算方法。这种在复杂组织采用多参数谱构建的功能图谱与来源于真核单细胞的基因相互作用谱具有相似的分辨率。这种基于整体动物或复杂组织表型谱的高分辨率基因网络构建方法为网络药理学研究提供了有力的实验研究工具。

1.3.2 斑马鱼(Danio rerio，zebrafish)

作为脊椎动物，斑马鱼与人类的基因同源性很高。斑马鱼的胚胎和幼鱼身体透明，眼部相对较大，胚胎平均大小为1.2 mm，成虫为6 cm，便于形态学检测和发育过程观察。利用活体成像技术可实时观测相关蛋白的表达、特定表型的(神经)细胞分布、神经生长或突触发育、神经系统损伤修复中神经元损伤后存活和修复及髓鞘再生等现象。另外，也可使用斑马鱼制造多种疾病模型以用于药物筛选和评价，如针对人的 APP，PSEN1，PSEN2，NCSTN，PSENEN和 BACE1，斑马鱼有与之对应的基因 APPa/b，psen1，psen2，ncstn，psenen和 zgc:77409。有人使用反义吗啡林(morpholino，MO)对斑马鱼的Pen-2(presenilin enhancer)基因的表达进行敲减探讨了Pen-2对神经存活的影响及其可能的机制［35］，为AD发病机制及防治药物研究提供了新的模型和实验体系。此外，也有人使用 1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP)诱导斑马鱼帕金森氏病模型［36］，使用五甲烯四氮唑(pentylenetetrazol，PTZ)诱导斑马鱼癫痫模型［37］等。这些研究提示斑马鱼在神经退行性疾病的研究中具有较为广泛的应用范围和应用前景。

基于报告基因，使用活的斑马鱼，可建立整体动物模型的高通量高内涵原位检测技术，从而实现活体药物的筛选和评价。如基于报告基因青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein，CFP)、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)、非稳定单体黄色荧光蛋白(destabilized monomeric yellow fluorescent protein，PhiYFP-dest1)、单体红色荧光蛋白(monomeric red fluorescent protein，tagRFP)、mCherry、2'，7'-二氯二氢-二乙酸盐(2'，7'-dichlorodihydrofluorescein-diacetate，DCFH-DA)，使用荧光读板机，每天可至少检测50 000个测试(unit)，其 Z'因子≥0.5，可使用斑马鱼胚胎、卵、幼虫定量分析细胞数量(如胰腺β细胞、视杆光感受器等)、细胞信号转导(如转Notch信号转导受体基因斑马鱼等)、细胞代谢(如活性氧积聚等)等［38］。Peravali等［39］使用斑马鱼基于标准宽域扫描显微镜建立了一种具有细胞分辨率的自动智能化高内涵技术，使用该技术建立了转基因斑马鱼的胚胎脑3-D数据库。而且根据背部准确定位，可获得高分辨率内部器官和细胞结构图像。使用转基因斑马鱼，采用定量的、高内涵图像分析技术在多孔板在体检测药物对纤维生长因子(fibroblast growth factor，FGF)信号转导的作用，结果表明包含FDA批准的药物在内的1040个化合物有两个分子即8－羟基喹啉硫酸酯(8-hydroxyquinoline sulfate)和巯氧吡啶锌(pyrithione zinc)具有增强脑中特定区域FGF信号转导的作用［40］。

2 双高通量基因表达检测技术

在网络药理学相关研究中，不论是基于实验的网络构建所需基本数据的获取，还是对所构建的网络模型进行实验验证，均需要使用具有检测样品高通量、检测目标基因高通量的双高通量、快捷、准确、灵敏的技术。显然，基于核酸杂交的基因芯片技术(基因组芯片、cDNA芯片、Oligo芯片、miRNA芯片等)因其每次只能检测一对样品而限制了其在网络药理学中的应用。

2002年Fakhari［41］提出的 PCR芯片技术，是将与研究对象有关的基因的引物固定于固相载体上，形成阵列，通过简单的、经过优化的定量PCR体系和荧光定量PCR仪，实现待检样品中基因的扩增，进而用于定量检测待检样品中基因的表达情况。与传统基于核酸杂交的基因芯片相比，PCR芯片具有操作流程简单、定量结果无需后期验证、特异性强、灵敏度高以及重复性好等优点。目前报道较多的有OpenArray®System(Applied Biosystems，USA)和 BioMark® System(Fluidigm，USA)。

OpenArray®System PCR芯片可同时检测96个样品的96个PCR反应，或每个样品可同时检测9216种基因。在一项基于中国人的病例-对照研究中，使用OpenArray® System检测了580例男性不育症和580例对照的6个抗氧化基因GPX1，CAT，PON1，NQO1，SOD2/MnSOD和SOD3的11个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)并进行基因分型，结果表明 PON1 Arg192Glu(rs662)和 SOD2 Val16Ala(rs4880)变异基因型与高风险男性不育症相关，携带有这两个变异基因型的个体其不育症发生风险高出两倍，而且这两个基因间存在互作。携带有PON1 Arg192Glu(rs662)或SOD2 Val16Ala(rs4880)的个体其精子DNA片段化和8－OHdG的水平也显著增高。表明抗氧化基因的遗传变异可导致精子DNA损伤与男性不育［42］。介导二噁英和多环芳氢等环境化合物毒性的配体激活转录因子芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AHR)的 SNP 中，rs2158041 的 G突变也与中国人男性不育有关［43］。同样在强直性脊柱炎研究中发现，基因STAT3，TNFRSF1A和2p15的多态性与中国汉族人的强直性脊柱炎有关［44］。另外，该系统也已用于O157和非O157型肠出血性大肠杆菌中与毒性、血清分型和噬菌体作用区有关的基因表达检测［45］。

BioMark®System集成流体通道(integrated fluidic circuits，IFC)PCR芯片目前最多可同时进行36 960个PCR反应。使用该系统的48×48动态阵列检测128例Ⅱ～Ⅲ期直肠癌患者血液中胸苷酸合成酶(thymidylate synthase，TS)、表皮生长因子(epidermal growth factor receptor)、切除修复交叉互补基因1(excision repair cross－complementing 1)、X射线修复交叉互补组1(X-ray repair cross-complementing group 1，XRCCG1)、着色性干皮病D组(xeroderma pigmentosum group D)基因的多态性，结果表明TS的基因多态性和XRCCG1 Arg399Gln多态性可辅助指示同步放化疗有较好预后的Ⅱ～Ⅲ期直肠癌患者［46］。同样使用该系统的48×48动态阵列检测了抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)抗体片段 C 部分(antibody fragment C portion，Fcγ)多态性和KRAS基因突变与104例用抗-EGFR抗体治疗的难治性转移性结直肠癌(refractory metastatic colorectal cancer，mCRC)临床疗效的相关性，结果表明，FccRIIa和FccRIIIa多态性并不是mCRC病人临床疗效有用的分子标记。因此，迄今为止，癌症分类的研究和治疗欧洲组织(European Organization for Research and Treatment of Cancer Classification，EORTC)、皮肤毒性和KRAS基因状态是唯一可靠的生物标志物，以确定患者受益于抗EGFR治疗［47］。另外，使用该系统对33例司他夫定(stavudine，d4T)处理的病人TS、亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)、二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase，DHFR)、还原叶酸载体1(reduced folate carrier 1，RFC1;SLC19A1)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)的基因多态性，结果表明TS基因的多态性与胞内司他夫定三磷酸腺苷(d4T-TP)水平和艾滋病毒/高活性抗逆转录病毒治疗相关的脂肪代谢障碍综合征(HIV/highly active antiretroviral therapy-associated lypodystrophy syndrome，HALS)病程高度相关［48］。

3 分子相互作用技术

从网络药理学角度揭示药物作用原理或对所构建的药物作用网络或预测模型进行验证的本质在于揭示药物分子与机体生物大分子之间的相互作用关系，因此需要观察药物与单个及多个生物分子之间的相互作用，同时也需要观察多个生物分子之间的相互作用。目前研究分子相互作用的方法有很多，但从检测通量和分子量范围来讲，主要有两种，一种是基于表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)的检测技术，另一种是基于生物膜层干涉(Bio-Layer Interferometry，BLI)的检测技术，这两种技术均具有无标记、高通量、高精度且实时检测的特点，能够提供分子相互作用结合速率常数(Ka)、解离速率常数(Kd)和亲和常数(KD)。

SPR技术的基本原理是当入射光以临界角射入，在金属膜表面内发生全反射，产生消失波，一定条件下消失波激发金属表面自由电子使之成为等离子体，而当表面等离子体与消失波的频率波数相等时，此时将发生共振现象并出现共振峰。当金属表面样品的折射率发生变化，共振峰的位置会发生相应的变化，由此可以检测待测物与配体发生的结合情况。金属与介质表面的存在是形成表面等离子体共振的基本条件之一，而检测生物分子间相互作用的特异性主要取决于偶联在传感器芯片表面的配体的特性。SPR生物传感器对温度和流体的湍流情况比较敏感，适于检测分子量较大(＞1000 Da)的分子。如在AD发病机制研究中，使用SPR技术研究Aβ聚集和寡聚体形成机制时，检测到Aβ42与微管聚合促进蛋白(tubulin polymerization promoting protein，TPPP/p25)的结合KD为85 nmol·L－1，可通过抑制生理性相关的TPPP/p25源微管聚集而导致异常蛋白的聚集［49］。Neuroligin-1(NL-1)是兴奋性突触的一个特异突触后细胞粘附蛋白，NL-1与Aβ的结合KD在nmol·L－1水平，而NL-2(抑制性突触的一个特异突触后细胞粘附蛋白)则与Aβ结合非常弱，研究表明NL-1而不是NL-2与Aβ相互作用增加Aβ寡聚体的形成［50］。在AD药物发现和药物机制研究中，基于SPR技术，将从脑脂质提取物分离的脂质膜固定在芯片上，并通过识别β-分泌酶(β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1，BACE1)的C-末端的抗体捕获BACE1，然后进行与BACE1相互作用分子的研究。这种技术能够更好的在接近生理条件下研究与BACE1相互作用的分子［51］，从而筛选BACE1抑制剂。使用SPR技术，检测人血白蛋白(Albutein)与sAβ42的结合KD的结果表明，血白蛋白可以与Aβ结合，可能对AD具有治疗作用［52］。γ-分泌酶调节剂舒林酸硫化物(sulindac sulfide)及其衍生物可直接与Aβ序列结合，而且γ-分泌酶调节剂和APP跨膜序列结合的减弱与Aβ42活性的降低、Aβ序列结合的强度高度相关，表明γ-分泌酶抑制剂降低Aβ42水平是通过调节APP跨膜序列相互作用来达到的［53］。

BLI的原理是用生物分子相容层覆盖光纤制成的生物传感器底端，用来固定相互作用分子中的一个，形成生物膜层。当分子相互作用发生时，生物层厚度增加，反射光干涉光谱曲线整体向波长增加方向移动。分子结合或解离时，都会导致干涉曲线的漂移。能直接检测血清、细胞裂解液、细菌、细胞培养液、组织匀浆等样品［54］。使用BLI技术在食蟹猴血浆中定量检测人源化抗体治疗疗效，结果表明，BLI技术与酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)技术具有同等的选择性、基质效应、精度和准确度，但靶点干扰方面BLI则优于ELISA。ELISA 的动态检测范围在0.1 ～10 mg·L－1，而BLI为0.4 ～50 mg·L－1。而且对于低浓度样品，BLI的重复性要高于ELISA［55］。BLI技术可以96和384孔的通量进行生物分子相互作用的检测，与SPR相比，更适于小分子特征的研究和片段筛选，通过以BCL-2，JNK1和eIF4E为靶点对6500个化合物的筛选，结果表明BLI技术不但可确证生物化学方法检测的结果，而且能够发现生化方法难以揭示的有着非典型结合谱的化合物和新候选化合物［54］。

4 展望

网络药理学从生物网络的角度系统地揭示药物和机体相互作用的规律和原理，发现基于网络生物学的疾病发病机制及药物作用靶点，创制基于生物网络的候选新药。网络药理学实验研究的技术与方法要求具有高通量、可定量、快速、灵敏度和准确性高的特点。除了组学技术外，目前能够在该领域发挥主要作用的有高通量/高内涵技术、双高通量基因表达检测技术和分子相互作用技术。但这些技术尚存在明显缺陷，仅能解决网络药理学实验研究中遇到的部分问题，如多数仅能实现分子或细胞水平的研究、可同时观察或检测的分子或生物效应有限、难以全面揭示生物机体内分子间及其与药物之间的复杂相互作用关系等等，因此，网络药理学实验研究相关新技术新方法的诞生仍是亟待解决的难题。

［1］Hopkins AL.Network pharmacology［J］.Nat Biotechnol，2007，25(10):1110-1111.

［2］Hopkins A L.Network pharmacology:the next paradigm in drug discovery［J］.Nat Chem Biol，2008，4(11):682-690.

［3］Mestres J，Gregori-Puigjane E，Valverde S，Sole RV.Data completeness－the Achilles heel of drug － target networks［J］.Nat Biotechnol，2008，26(9):983-984.

［4］Gu J，Zhang H，Chen L，Xu S，Yuan G，Xu X.Drug-target network and polypharmacology studies of a Traditional Chinese Medicine for typeⅡ diabetes mellitus［J］.Comput Biol Chem，2011，35(5):293-297.

［5］Yan J，Wang Y，Luo SJ，Qiao YJ.TCM grammar systems:an approach to aid the interpretation of the molecular interactions in Chinese herbal medicine［J］.J Ethnopharmacol，2011，137(1):77-84.

［6］Ma C，Yao Y，Yue QX，Zhou XW，Yang PY，Wu WY，et al.Differential proteomic analysis of platelets suggested possible signal cascades network in platelets treated with salvianolic acid B［J］.PloSone，2011，6(2):e14692.

［7］Jain S，Heutink P.From single genes to gene networks:highthroughput-high-content screening for neurological disease［J］.Neuron，2010，68(2):207-217.

［8］Dragunow M.High-content analysis in neuroscience［J］.Neurosci，2008，9(10):779-788.

［9］Arrasate M，Finkbeiner S.Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate［J］.Proc Nat Acad Sci USA，2005，102(10):3840-3845.

［10］Lundkvist J，Naslund J.Gamma-secretase:a complex target for Alzheimer's disease［J］.Curr Opin Pharmcol，2007，7(1):112-118.

［11］Florean C，Zampese E，Zanese M，Brunello L，Ichas F，De Giorgi F，et al.High content analysis of gamma-secretase activity reveals variable dominance of presenilin mutations linked to familial Alzheimer's disease［J］.Biochimi Biophy Acta，2008，1783(8):1551-1560.

［12］Hu M， Schurdak ME， Puttfarcken PS， El Kouhen R，Gopalakrishnan M，Li J.High content screen microscopy analysis of A beta 1-42-induced neurite outgrowth reduction in rat primary cortical neurons:neuroprotective effects of alpha7 neuronal nicotinic acetylcholine receptor ligands［J］.Brain Res，2007，1151:227-235.

［13］Azorsa DO，Robeson RH，Frost D，Meec hoovet B，Brautigam GR，Dickey C，et al.High-content siRNA screening of the ki-nome identifies kinases involved in Alzheimer＇s disease － related tau hyperphosphorylation［J］.BMC Genomics，2010，11:25.

［14］Radio NM，Freudenrich TM，Robinette BL，Crofton KM，Mundy WR.Comparison of PC12 and cerebellar granule cell cultures for evaluating neurite outgrowth using high content analysis［J］.Neurotoxicol Teratol，2010，32(1):25-35.

［15］Jain S，van Kesteren RE，Heutink P.High content screening in neurodegenerative diseases［J］.J Visualized Exp，2012.In press.(59):e3452.

［16］Harrill JA，Robinette BL，Mundy WR.Use of high content image analysis to detect chemical-induced changes in synaptogenesis in vitro［J］.Toxicol in vitro，2011，25(1):368-387.

［17］Ofengeim D，Shi P，Miao B，Fan J，Xia X，Fan Y，et al.Identification of small molecule inhibitors of neurite loss induced by Abeta peptide using high-content screening［J］.J Biol Chem，2012.In press.

［18］Nederlof M，Watanabe S，Burnip B，Taylor DL，Critchley-Thorne R.High-throughput profiling of tissue and tissue model microarrays:Combined transmitted light and 3-color fluorescence digital pathology［J］.J Pathol informatics，2011，2:50.

［19］Gould PV，Saikali S.A comparison of digitized frozen section and smear preparations for intraoperative neurotelepathology［J］.Anal Cell Pathol(Amst)，2012，35(2):85-91.

［20］Gould PV，Saikali S.A comparison of digitized frozen section and smear preparations for intraoperative neurotelepathology［J］.Anal Cell Pathol(Amst)，2011.In press.

［21］Samaroo HD，Opsahl AC，Schreiber J，O'Neill SM，Marconi M，Qian J，et al.High throughput object-based image analysis of beta-amyloid plaques in human and transgenic mouse brain［J］.J Neurosci Meth，2012，204(1):179-188.

［22］Maximova OA，Murphy BR，Pletnev AG.High-throughput automated image analysis of neuroinflammation and neurodegeneration enables quantitative assessment of virus neurovirulence［J］.Vaccine，2010，28(52):8315-8326.

［23］Josephs KA，Whitwell JL，Ahmed Z，Shiung MM，Weigand SD，Knopman DS，et al.Beta-amyloid burden is not associated with rates of brain atrophy［J］.Annals Neurol，2008，63(2):204-212.

［24］Nielsen PS，Lindebjerg J，Rasmussen J，Starklint H，Waldstrom M，Nielsen B.Virtual microscopy:an evaluation of its validity and diagnostic performance in routine histologic diagnosis of skin tumors［J］.Hum Pathol，2010，41(12):1770-1776.

［25］Tokuno H，Tanaka I，Senoo A，Umitsu Y，Akazawa T，Nakamura Y，et al.Internet-based atlas of the primate spinal cord［J］.Neurosci Res，2011，70(1):128-132.

［26］Slodkowska J，Chyczewski L，Wojciechowski M.Virtual slides:application in pulmonary pathology consultations［J］.Folia histochemica et cytobiologica/Polish Academy of Sciences，Polish Histochemical and Cytochemical Society，2008，46(1):121-124.

［27］Kortenhorst MS，Isharwal S，van Diest PJ，Chowdhury WH，Marlow C，Carducci MA，et al.Valproic acid causes dose-and timedependent changes in nuclear structure in prostate cancer cells in vitro and in vivo［J］.Mol Cancer Therap，2009，8(4):802-808.

［28］Lopez AM，Graham AR，Barker GP，Richter LC，Krupinski EA，Lian F，et al.Virtual slide telepathology enables an innovative telehealth rapid breast care clinic［J］.Hum Pathol，2009，40(8):1082-1091.

［29］Berretta N，Ledonne A，Mango D，Bernardi G，Mercuri NB.Hippocampus versus entorhinal cortex decoupling by an NR2 subunit-specific block of NMDA receptors in a rat in vitro model of temporal lobe epilepsy［J］.Epilepsia，2012.In press.

［30］Bastrikova N，Gardner GA，Reece JM，Jeromin A，Dudek SM.Synapse elimination accompanies functional plasticity in hippocampal neurons［J］.Proc Nat Acad Sci USA，2008，105(8):3123-3127.

［31］Jahnke HG，Braesigk A，Mack TG，Ponick S，Striggow F，Robitzki AA.Impedance spectroscopy based measurement system for quantitative and label-free real-time monitoring of tauopathy in hippocampal slice cultures［J］.Biosensors Bioelec，2012，32(1):250-258.

［32］Albrecht DR，Bargmann CI.High-content behavioral analysis of Caenorhabditis elegans in precise spatiotemporal chemical environments［J］.Nat Met，2011，8(7):599-605.

［33］Klapper M，Ehmke M，Palgunow D，Bohme M，Matthaus C，Bergner G，et al.Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches［J］.J Lipid Res，2011，52(6):1281-1293.

［34］Green RA，Kao H-L，Audhya A，Arur S，Mayers Jonathan R，Fridolfsson HN，et al.A High-Resolution C.elegans Essential Gene Network Based on Phenotypic Profiling of a Complex Tissue［J］.Cell，2011，145(3):470-482.

［35］Campbell WA，Yang H，Zetterberg H，Baulac S，Sears JA，Liu T，et al.Zebrafish lacking Alzheimer presenilin enhancer 2(Pen-2)demonstrate excessive p53-dependent apoptosis and neuronal loss［J］.J Neurochem，2006，96(5):1423-1440.

［36］Sallinen V，Kolehmainen J，Priyadarshini M，Toleikyte G，Chen YC，Panula P.Dopaminergic cell damage and vulnerability to MPTP in Pink1 knockdown zebrafish［J］.Neurobio Dis，2010，40(1):93-101.

［37］Siebel AM，Piato AL，Capiotti KM，Seibt KJ，Bogo MR，Bonan CD.PTZ-induced seizures inhibit adenosine deamination in adult zebrafish brain membranes［J］.Brain Res Bull，2011，86(5-6):385-389.

［38］Walker SL，Ariga J，Mathias JR，Coothankandaswamy V，Xie X，Distel M，et al.Automated reporter quantification in vivo:high-throughput screening method for reporter-based assays in zebrafish［J］.PloSone，2012，7(1):e29916.

［39］Peravali R，Gehrig J，Giselbrecht S，Lutjohann DS，Hadzhiev Y，Muller F，et al.Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos［J］.BioTechniques，2011，50(5):319-324.

［40］Saydmohammed M，Vollmer LL，Onuoha EO，Vogt A，Tsang M.A high-content screening assay in transgenic zebrafish identifies two novel activators of fgf signaling［J］.Birth defects research，2011，93(3):281-287.

［41］Fakhari FD，Dittmer DP.Charting latency transcripts in Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus by whole-genome real-time quantitative PCR［J］.J Virol，2002，76(12):6213-6223.

［42］Ji G，Gu A，Wang Y，Huang C，Hu F，Zhou Y，et al.Genetic variants in antioxidant genes are associated with sperm DNA damage and risk of male infertility in a Chinese population［J］.Free Rad Biol Med，2012，52(4):775-780.

［43］Gu A，Ji G，Long Y，Zhou Y，Shi X，Song L，et al.Assessmentof an association between an aryl hydrocarbon receptor gene(AHR)polymorphism and risk of male infertility［J］.Toxicol Sci，2011，122(2):415-421.

［44］Davidson SI，Liu Y，Danoy PA，Wu X，Thomas GP，Jiang L，et al.Association of STAT3 and TNFRSF1A with ankylosing spondylitis in Han Chinese［J］.Annals Rheumatic Dis，2011，70(2):289-292.

［45］Gonzales TK，Kulow M，Park DJ，Kaspar CW，Anklam KS，Pertzborn KM，et al.A high-throughput open-array qPCRgene panel to identify，virulotype，and subtype O157 and non-O157 enterohemorrhagic Escherichia coli［J］.Mol Cell Probes，2011，25(5-6):222-230.

［46］Paez D，Salazar J，Pare L，Pertriz L，Targarona E，del Rio E，et al.Pharmacogenetic study in rectal cancer patients treated with preoperative chemoradiotherapy:polymorphisms in thymidylate synthase，epidermal growth factor receptor，GSTP1，and DNA repair genes［J］.Int J Radiat Oncol，Biol，Phys，2011，81(5):1319-1327.

［47］Paez D，Pare L，Espinosa I，Salazar J，del Rio E，Barnadas A，et al.Immunoglobulin G fragment C receptor polymorphisms and KRAS mutations:are they useful biomarkers of clinical outcome in advanced colorectal cancer treated with anti-EGFR-based therapy?［J］.Cancer Sci，2010，101(9):2048-2053.

［48］Domingo P，Cabeza MC，Pruvost A，Torres F，Salazar J，del Mar Gutierrez M，et al.Association of thymidylate synthase gene polymorphisms with stavudine triphosphate intracellular levels and lipodystrophy［J］.Antimicrob Agents Chemother，2011，55(4):1428-1435.

［49］Olah J，Vincze O，Virok D，Simon D，Bozso Z，Tokesi N，et al.Interactions of pathological hallmark proteins:tubulin polymerization promoting protein/p25，beta-amyloid，and alpha-synuclein［J］.J Biol Chem，2011，286(39):34088-34100.

［50］Dinamarca MC，Weinstein D，Monasterio O，Inestrosa NC.The synaptic protein neuroligin-1 interacts with the amyloid beta-peptide.Is there a role in Alzheimer's disease?［J］.Biochem，2011，50(38):8127-8137.

［51］Christopeit T，Stenberg G，Gossas T，Nystrom S，Baraznenok V，Lindstrom E，et al.A surface plasmon resonance-based biosensor with full-length BACE1 in a reconstituted membrane［J］.Anal Biochem，2011，414(1):14-22.

［52］Costa M，Ortiz AM，Jorquera JI.Therapeutic Albumin Binding to Remove Amyloid-beta［J］.J Alzheimer's Dis，2012.In press.

［53］Richter L，Munter LM，Ness J，Hildebrand PW，Dasari M，Unterreitmeier S，et al.Amyloid beta 42 peptide(Abeta42)-lowering compounds directly bind to Abeta and interfere with amyloid precursor protein(APP)transmembrane dimerization［J］.Proc Nat Acad Sci USA，2010，107(33):14597-14602.

［54］Wartchow CA，Podlaski F，Li S，Rowan K，Zhang X，Mark D，et al.Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry［J］.J Comput-aided Mol Design，2011，25(7):669-676.

［55］Dysinger M，King LE.Practical quantitative and kinetic applications of bio-layer interferometry for toxicokinetic analysis of a monoclonal antibody therapeutic［J］.J Immunol Meth，2012.In press.