血浆EB病毒DNA检测在鼻咽癌中的应用进展

黄爽 管西寅 应红梅

复旦大学附属肿瘤医院放疗科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是1964年Epstein和Barr从瘤细胞中发现的一种嗜人类B淋巴细胞的疱疹病毒，以线性双链DNA形式存在，基因组长约172 kb。EBV感染与鼻咽癌、淋巴瘤等多种疾病的发生密切相关，在人体中主要以潜伏感染形式存在，因此血液中存在多种病毒基因产物如EBNAs、EBERs、各种潜伏膜蛋白及EBV相关的抗原、抗体。目前，在鼻咽癌中常用的筛查指标EBV壳抗原IgA抗体(VCA-IgA)和早期抗原IgA抗体(EA-IgA)，其变化水平落后于体内EBV的变化，不能及时反映肿瘤消长和疾病进展的关系［1］。随着分子生物学技术的发展，多项研究发现鼻咽癌患者外周血中检测到的EBV DNA可以随肿瘤消长而变化，能有效监测鼻咽癌的发生、发展情况［2-5］，是一种优于VCA-IgA、EA-IgA的肿瘤检测指标［6-7］。

1 血浆中EBV DNA在鼻咽癌中的应用基础

Chan等［8］用DNA酶切和超高速离心后定量法证实，血浆中EB病毒DNA (EBV DNA)以游离DNA片段而非完整病毒颗粒的形式存在于细胞外，绝大多数游离DNA片段大小在82~181 kb之间。检测血浆中EBV游离DNA片段的方法主要有常规聚合酶链反应(PCR)、半定量巢式PCR和实时定量PCR(real time qPCR，RT-qPCR)，后者在灵敏度、特异度和准确定量等方面优于前两者，故为最常用的方法。各种PCR均是通过检测特定的DNA片段来实现定性或定量的，EBV的常用目标片段有EBNA-1、EBNA-2、BXLF-1基因及Bam HI-w区域，均能够得到相似的阳性结果［2,9-10］。Bam HI-w区域是EBV的高度保守和高度重复序列，因病毒株不同可重复10～12次，检测该片段能够提高临床检测的灵敏度及特异度［11］，因此临床实验中多用BamHI-W区域作为检测的目标片段。各项研究由于所采用的实验设计、PCR设备及方法上的差异，实验数据之间存在明显差异性［12］。影响因素主要有几个方面：①游离EBV DNA的片段多在181 bp以内，因此PCR所选择的扩增子应尽可能在181 bp以内，不同的扩增子所得到的定量结果有差异；②PCR所使用的循环数、试剂、引物或探针不同，检出率和定量结果也有差异［13］。因此构建EBV DNA的荧光定量PCR标准品来统一实验条件，制定国际通用的校准标准能够让各实验室的结果具有可比性，进而使血浆EBV DNA能够成为一个通用的血液学指标。

Mutirangura等［2］运用RT-PCR技术发现，31%的鼻咽癌患者血清EBV DNA为阳性，而曾感染过EBV的82名健康对照者血清中并未检出，说明血清中的EBV DNA是肿瘤源性的，且统计分析指出肿瘤细胞凋亡与血浆EBV DNA独立相关(P=0.046)。Lin等［3］比较了99例鼻咽癌患者血浆和原发肿瘤的EBV基因型，并分别对PCR产物测序，也证实了血浆EBV DNA来源于整合了EBV的鼻咽癌细胞，能很好地反映体内肿瘤的负荷状况。对于EBV DNA具体的入血机制尚未完全清楚，目前多数观点认为，原发部位肿瘤细胞将EBV DNA直接释放入血，并非病毒在外周血中复制的作用［2,14-16］。血浆EBV DNA的含量与肿瘤细胞凋亡数成正相关，且在细胞凋亡过程中，脱氧核苷酸酶切割通常使DNA裂解为181 bp以内的小片段，因此其入血机制很可能与细胞凋亡裂解相关，而与宏观的肿瘤入侵周围血管床无明显相关性。

2 血浆EBV-DNA浓度与鼻咽癌诊断、分期的关系

Hsiao等［9］采用常规PCR技术检测鼻咽癌患者血浆EBV-DNA阳性率为38.9%(14/36)，健康对照组检出率为3.6%(1/28)。当PCR循环数由35增加到50时，患者及对照组的检出率分别为72.2%(26/36)和10.7%(3/28)。Tan等［10］应用RT-PCR技术检测游离EBV DNA片段，鼻咽癌患者的检出阳性率明显高于正常人群，鼻咽癌患者DNA定量(每毫升的中位拷贝数为2 043 mL)和正常人群(中位拷贝数为0)差异有统计学意义(P<0.000 5)。这与其他相关研究的结果一致［3,11,15］，说明了血浆EBV DNA在鼻咽癌诊断上的价值。Leung等［6］对血浆EBV DNA游离片段在鼻咽癌诊断中的特异度和灵敏度分析得出其灵敏度为95%(95%CI：91%～98%)，特异度为98%。其与VCA-IgA在假阴性结果上几乎没有重叠，但能够纠正75%(27/36)的VCA/ IgA假阳性的错误，故用两者结合诊断灵敏度可高达99%。2011年的一项Meta分析纳入了15项关于血浆及血清EBV-DNA水平与鼻咽癌相关性的研究，同样证实了EBV DNA在鼻咽癌诊断上良好的灵敏度(89.1%)和特异度(85%)［17］。因此，血浆EBV DNA水平可以作为鼻咽癌诊断的一种新的特异度和灵敏度较好的血清学指标，其与血清VCA-IgA结合能进一步提高诊断价值。

在Lin等［3］的研究中，Ⅲ、Ⅳ期及远处转移患者治疗前DNA的中位拷贝数分别为681、1 703和291 940/mL(P<0.001)，提示血浆EBV DNA水平与肿瘤分期有明显的相关性。临床分期越晚，血浆中EBV-DNA浓度水平越高［18］。2006年，Leung等［19］针对血浆EBV DNA与分期作了更详细的研究认为，血浆EBV DNA水平是总生存(overall survival，OS)的独立预后因素，仅次于UICC分期。对于Ⅰ、Ⅱ期患者来说，高的血浆EBV DNA水平提示预后不良(P=0.000 3)，高血浆EBV DNA水平组(包括6%的Ⅰ期患者和38%的Ⅱ期患者)与Ⅲ期患者的生存期望相同或者更差；反之，低血浆EBV DNA水平组(包括大部分Ⅱ期患者)的生存期望与Ⅰ期患者相同。此外，EBV DNA水平也被证实与中国2008 TNM分期呈正相关，能较好在国内临床中得到应用［20］。故认为，血浆EBV DNA的水平与临床分期密切相关，可以用来补充TNM分期。但Leung等［19］的分析中使用的分期标准为UICC 1997版本，且剔除了所有M1和病理类型为Ⅰ型的患者，对于临床的指导价值有所削弱，期待采用最新分期标准的实验验证。

3 治疗前后血浆EBV DNA浓度对鼻咽癌复发转移的预测作用

3.1 治疗前血浆EBV-DNA基线浓度在鼻咽癌中的应用意义

Lo等［11］的数据显示治疗后1年内出现复发或转移的患者其治疗前血浆EBV DNA中位拷贝数(41 756/mL)远高于未出现临床进展的患者(5 807/mL)。治疗前血浆EBV DNA浓度是鼻咽癌的独立预后因素，其浓度每增加10倍，局部复发和远处转移的相对危险度达4.5(95%CI：1.9～10.4)。Lin等［3］发现治疗前血浆EBV-DNA的基线浓度与肿瘤负荷呈正相关，与疾病预后呈负相关。鼻咽癌治疗后复发的患者其治疗前血浆中的EBV-DNA浓度明显高于无复发者(中位拷贝数分别为：3 035和1 202/mL；P=0.02)。治疗前血浆EBV-DNA浓度在1 500/mL的界值以下的患者OS和无复发生存(recurrence-free survival，RFS)都长于治疗前浓度超过界值者(P<0.05)。侯雪等［21］也得出相似结论，治疗前EBV-DNA浓度超过界值点(2 000/mL)的患者，其2年OS (P=0.05)也低于EBV-DNA 浓度在界值之下的患者。

在各项研究中所选取的治疗前、后血浆EBV DNA浓度的界值点各不相同，都是基于前人实验经验和秩检验对OS及PFS异质性的估量所选择的，Chan等［22］的结果表明，界值点取在治疗前4 000/mL，治疗后500/mL能够很好地区分不同组别的预后，但对于血浆EBV DNA预后预测的总体效应而言，界值点选取的不同并无差别。

3.2 治疗后血浆EBV-DNA浓度对鼻咽癌预后的预测作用

未转移的初治鼻咽癌，治疗后持续存在的血浆EBV-DNA是预后的不良因素。Wang等［23］采用血浆EBV DNA检测结合PET-CT的方法对治疗后的NPC患者进行60个月的随访发现，治疗后血浆中持续存在可检测EBV DNA的患者几乎都出现了复发或转移，且预测的灵敏度优于PET-CT，能够筛选出需要用PET-CT寻找确切转移复发灶的部分患者，提高了准确性。Lin等［13］对152例接受标准同期放化疗的患者进行了78个月的随访，同样发现治疗后持续存在EBV DNA的患者5年OS和RFS显著低于治疗后血浆DNA阴性者(P<0.000 1)，且COX分析指出，血浆EBV DNA浓度水平对于预后的预测效力要优于包括病理类型、T分期、N分期及总分期在内的其他临床参数。

初治后出现复发/转移或治疗前已有转移的鼻咽癌患者中，血浆EBV DNA仍有重要预测价值。Xin等［24］对127例接受姑息化疗的鼻咽癌患者的血浆EBV-DNA进行定量分析，治疗前血浆EBV DNA浓度低于中位基线浓度(2.33×105/mL)与EBV DNA浓度等于或高于中位值者相比，中位OS和PFS明显延长(P<0.001)。姑息化疗后血浆EBV-DNA降至不可检测水平的患者，不仅缓解率(CR+PR)明显高于血浆EBV DNA持续存在者，生存期也明显延长。与初治无转移鼻咽癌中的研究结果一致［13］，Xin等［24］指出治疗前血浆EBV DNA低且治疗后降至不可检测水平的一组患者，5年的OS和PFS均明显优于其他各组患者。可以认为，治疗后血浆EBV DNA持续存在者出现临床疾病进展的风险更高，预后更差，可以考虑采取缩短随访间隔、增加随访项目等手段。

与治疗前血浆EBV DNA相比，治疗后EBV DNA浓度对于鼻咽癌复发转移的预测意义更大，尤其是治疗后血浆EBV DNA水平能否及时降到0［3,13,18,22］。因为治疗后外周血中仍存在的EBV-DNA可能是由治疗前或者治疗时游离于循环中的潜在微转移肿瘤细胞所释放，这些未完全清除的肿瘤细胞通过其他临床检查较难发现。但是仅靠EBV DNA浓度并不能进一步将可能发生远处转移和局部或区域复发的患者区分开。Leung等［25］发现血浆EBV DNA在局部复发患者中检出率明显低于远处转移和治疗前鼻咽癌患者。龚晓昌等［26］也发现远处转移患者血浆EBV-DNA阳性率和拷贝数与前述报道相似，而局部复发患者血浆EBV-DNA的阳性率远低于前者。这可能是因为放疗反应引起了局部严重纤维化和血管狭窄闭塞导致局部复发的肿瘤细胞无法将EBV DNA释放入血。

鼻咽癌虽对放疗敏感，但根治性放疗后的远处转移或局部复发仍是治疗失败的原因。评价鼻咽癌疗效的影像学手段如鼻咽MRI、CT等检查多在放化疗后立即进行，此时鼻咽部及其周围组织由于放疗反应产生的肿胀等因素，易影响解剖观察，单纯依靠影像学不能早期反映疗效，预测预后。而血浆EBV-DNA浓度能很好地辅助影像学手段，预测肿瘤复发和转移发生的风险及生存状况，是一项非侵入性的分子生物学检查指标，更有望成为筛选鼻咽癌高危患者，指导放化疗综合治疗的标准之一。

3.3 治疗后血浆EBV-DNA浓度下降速度对预后的意义

放疗中血浆EBV DNA的中位半衰期为3.8 d(四分位间距：2.4～4.4 d)［27］，治疗后血浆EBV DNA在几乎所有患者中都能观察到下降，仅下降的速率和程度不一致。Xin等［24］发现姑息化疗后血浆EBV DNA早期下降的患者中位PFS、OS明显延长，血浆EBV DNA的早期消失可以作为一项疗效反应的早期指标。Wang等［28］研究34例转移及复发的晚期鼻咽癌患者化疗后第1个月的血浆EBV-DNA清除率(t1/2)也认为清除率较血浆EBV DNA含量对疗效的预测效果更好。由于该研究样本量小，CR、PR率高于普遍报道，提示可能存在患者选择的偏移。Hsu等［29］将研究的样本量增至73例，发现治疗前的血浆EBV DNA清除率与DNA定量同样能有效预测预后。但既往研究对血浆EBV DNA的清除率及其定量结果在整个治疗过程中的动态变化规律、是否对疗效、分期等有预测价值的相关研究较少，可以作为一个新的突破点继续研究。

4 结语

综上所述，监测不同时期的血浆EBV DNA在鼻咽癌早期诊断、临床分期、疗效监测、预后判断等方面有重要的临床意义，优于传统检测抗体的方法。在未来的研究中，仍有一些问题需要解决：①肿瘤细胞中的EBV DNA释放入血的具体机制；②规范化血浆EBV DNA的定量检测流程，使不同的研究中心检测结果具有统一性和可比性；③治疗后长期随访过程中，确定血浆EBV DNA的最佳随访时间及随访间隔；④对于治疗后血浆EBV DNA持续存在或者升高的那部分患者应采取的后续治疗措施；⑤血浆EBV DNA能否与TNM分期结合，形成更有利于指导治疗的临床分期。即使存在很多问题尚未解决,不可否认的是血浆游离EBV DNA的检测确实为诊断和监测NPC带来了新的希望,未来很可能成为临床上广泛使用的一种非侵入性的血清肿瘤学指标，但由于条件及费用等的限制，EBV DNA作为一项常规肿瘤学检查指标还有待推广。

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