猪链球菌细胞壁蛋白SSU05＿0272的表达、纯化及生物活性分析＊

陈 哲，郑玉玲，郝淮杰，律清宇，任志强，王 涛，姜永强，吕淑霞

猪链球菌血清2型（Streptococcus suis serotype 2，Ss2）是一个重要的新发病原体，不仅能够感染动物，引起脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎等，还能感染人，引起脑膜炎、链球菌中毒性休克样综合征等。1998年和2005年，我国先后暴发了2次比较大规模的流行，共造成200多人感染，50多人死亡［1］，对猪的产业经济带来了巨大的损失，引起了世界范围内的关注［2］。但目前其致病机制还不是很清楚［3］。

细菌的表面蛋白和分泌蛋白在细菌感染中起重要作用。理论上，表面蛋白的抗原能够有效的提高免疫应答的效率，可作为疫苗的重要组成成分［4］。我们在前期免疫蛋白质组研究中，发现SSU05＿0272蛋白为潜在的毒力因子和保护性表面蛋白，但其生物学功能还不清楚。本研究旨在构建SSU05＿0272基因的重组表达质粒，获得高纯度蛋白，并研究其对细胞因子的调控功能。

1 材料与方法

1．1 材料BamHI、Xho I内切酶，Taq DNA聚合酶，IPTG，大肠杆菌DH5（感受态细胞购自TaKaRa公司；BL21（DE3）购自天根公司；T4DNA连接酶，pCR○R2．1 载 体，RNA 提 取 试 剂 盒 （PureLinkTMRNA Mini kit）、SYBR Green染料购自Invitrogen公司；pET－28a（＋）表达载体购自 Novagen公司；质粒DNA提取试剂盒及胶回收试剂盒购自东盛公司；PCR 引物（0272／PF：5′－GTT GGA TCC GAA TCG CTA GAA C－3′，0272／PR：5′－TAT CTC GAG TCA ACT TGC TTC GCC TG－3′）由上海生工生物工程有限公司合成；Ni－NTA agarose、Hi－Trap Q HP购自GE公司；《显色基质鲎试剂盒》购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司；EBM－2（lonza）购自北京泽平科技责任有限公司；胎牛血清（BD）；QuantiTect Reverse Transcription Handbook反转录试剂盒购自QIAGEN公司，人脑微血管内皮细胞系hCMEC／D3由法国P－O Couraud教授惠赠。

1．2 方法

1．2．1 细胞培养 人脑微血管内皮细胞系hCMEC／D3由法国国家医学卫生研究院（INSERM）的Pierre－Olivier Couraud教授惠赠。人BMEC细胞系hCMEC／D3培养基为：EBM－2中加入如下成分：FBS（5%），氢化可的松（1．4μmol／L），抗坏血酸（5 μg／mL），化学成分确定脂溶液（1／100），HEPES（10 mM），bFGF（1ng／mL），青霉素（100U／mL），链霉素（100U／mL）。培养瓶或培养板用0．01%的鼠尾胶原溶液按6～10μg／cm2的量37℃包被数小时，去除多余液体，过夜干燥，用无菌组织培养基水漂洗后，接种hCMEC／D3细胞进行培养。

1．2．2 SSU05＿0272重组表达质粒的构建 以猪链球菌05ZYH33基因组为模版，以0272／PF、0272／PR为引物进行PCR扩增SSU05＿0272基因。扩增条件为：94℃预变性7min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸150s，32个循环；扩增产物经10g／L琼脂糖电泳后按照DNA胶回收试剂盒的操作步骤纯化回收扩增产物。PCR产物经TA克隆连接至pCR○R2．1载体，转化至E．coli DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，挑取白色菌落进行菌落PCR鉴定。阳性克隆质粒经BamH I和Xho I酶切后连接到表达载体pET28a（＋），并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中。质粒提取后，进行酶切和测序鉴定。

1．2．3 SSU05＿0272蛋白的表达 将含有重组蛋白基因表达质粒的大肠杆菌BL21（DE3）接种到卡那霉素抗性（50μg／mL）的LB培养基中，30℃水浴振荡培养至A600为0．4左右，加入IPTG（终浓度1 mmol／L）继续培养6．5h，离心集菌，进行 SDSPAGE电泳分析结果。

1．2．4 SSU05＿0272蛋白的纯化 将离心后沉淀用buffer A（5mmol／L PB，pH7．0）重悬，超声破菌，确定为上清表达，离心弃沉淀，0．45μm滤膜抽滤，buffer B（5mmol／L PB，pH7．0，0．5mol／L NaCl，5mmol／L咪唑）稀释后上样于经buffer B平衡过的Ni－NTA agarose柱。上样结束后buffer C（5mmol／L PB，0．5mol／L NaCl，0．5mol／L咪唑）进行梯度洗脱。纯化出的蛋白透析后经A液（5 mmol／L PB，pH7．0，0．5mol／L NaCl）稀释，上样于经A液平衡过的HiTrap Q HP柱。上样结束后，B液（5mmol／L PB，pH7．0）进行梯度洗脱，SDSPAGE鉴定蛋白纯度。

1．2．5 Triton X－114 抽提重组 SSU05＿0272蛋白中LPS Triton X－114以1%比例加入到纯化后的蛋白中，混匀后4℃放置30min，37℃ 水浴10 min，25℃20 000g离心10min，收集上清。

1．2．6 鲎试剂检测重组SSU05＿0272蛋白中的LPS含量 按照《显色基质鲎试剂盒》（厦门市鲎试剂实验厂有限公司）说明书的操作步骤对SSU05＿0272蛋白中LPS的含量进行检测。

1．2．7 RT－PCR检测SSU05＿0272蛋白与人脑微血管内皮细胞作用后细胞因子的变化 人脑微血管内皮细胞系hCMEC／D3经0．25%胰酶消化后3×105个／mL接种于0．01%的鼠尾胶原（6－10μg／cm2）包被过的6孔板中，细胞生长至单层后无菌PBS洗一次，每孔加入500ng／mL的细胞培养基稀释的SSU05＿0272蛋白，分别作用0h、1h、3h、6h后，利用Invitrogen PureLinkTMRNA Mini kit提取总RNA，NanoDrop 2000进行核酸定量，琼脂糖电泳判定纯度。按照QIAGEN公司的QuantiTect Reverse Transcription Handbook说明书进行反转录。采用SYBR Green法进行RT－PCR检测。程序为：95℃激活HotStar DNA聚合酶2min，运行40个循环，循环条件为：95℃变性15s，60℃退火60s，退火步骤进行荧光采集。以β－actin为参考基因，用2AACt方法进行不同条件下基因的相对定量。引物序列见表1。

表1 细胞因子的引物序列Tab．1 The sequences of cytokine primers

1．3 数据处理 EXCEL2003建立数据库，Graph－Pad Prism 5进行统计分析，计量单位采用t检验。

2 结 果

2．1 SSU05＿0272重组表达质粒的构建及鉴定以05ZYH33基因组为模版，0272／PF、0272／PR进行PCR扩增后，得到大小为1 932bp的目的片段，见图1。将该基因片段回收后经TA克隆连接到PCR○R

2．2 载体，挑取阳性克隆经双酶切鉴定后成功连接到表达载体pET－28a（＋）上，转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后，挑取阳性克隆进行PCR鉴定，BamH I和Xho I双酶切鉴定，见图2。及测序结果显示，得到的重组质粒与预期一致。

图1 SSU05＿0272基因PCR扩增产物的凝胶电泳Fig．1 SDS－PAGE on PCR product of SSU05＿0272geneM：DNA marker；1：SSU05＿0272基因扩增片段

2．3 SSU05＿0272的表达纯化 将含有SSU05＿0272基因的大肠杆菌诱导后离心集菌，超声破碎后行SDS－PAGE电泳，确定为上清表达。稀释上清后，经过镍亲和层析和阴离子交换层析纯化后，得到重组的纯化蛋白。经SDS－PAGE电泳鉴定纯化后的蛋白纯度在90%以上，见图3。

图2 SSU05＿0272－pET28a（＋）重组表达质粒的酶切鉴定Fig．2 Restriction endonuclease digestion of the recombinant expression plasmid SSU05＿0272－pET28a（＋）M：DNA marker；1：质粒双酶切产物

图3 SDS－PAGE电泳检测重组蛋白的纯化Fig．3 SDS－PAGE of the purified recombinant proteinM：蛋白 marker；1：SSU05＿0272蛋白

2．4 Triton X－114 抽提重组SSU05＿0272蛋白中LPS 用Triton X－114法对纯化后的SSU05＿0272蛋白中的LPS进行抽提，离心后获得的上清即为目的蛋白。

2．5 鲎试剂检测重组SSU05＿0272蛋白中LPS的含量 《显色基质鲎试剂盒》检测结果显示，最后获得的SSU05＿0272重组蛋白中LPS含量＜0．03 EU／mL，符合国家标准。

2．6 SSU05＿0272蛋白与人脑微血管内皮细胞作用后细胞因子变化的RT－PCR检测 终浓度500 ng／mL的SSU05＿0272蛋白与人脑微血管内皮细胞分别作用0h、1h、3h、6h后，提取细胞的总RNA，NanoDrop 2000进行核酸定量后进行反转录。SYBR Green法进行实时定量PCR检测，结果显示，SSU05＿0272蛋白能够上调IL－6、IL－8、TNF－α、IL－1β的表达（P＜0．05），下调IL－12P40的表达（P＜0．01），而不影响IL－12P70的表达，图4。

图4 SSU05＿0272蛋白与hCMEC／D3作用后细胞因子的变化情况Fig．4 The transcriptional level changes of cytokine after the interaction of SSU05＿0272protein and hCMEC／D3

3 讨 论

SSU05＿0272作为一个细胞壁蛋白，被命名为翻译起始因子GTP酶，是一个具有免疫原性的细胞壁蛋白［5］，其抗血清蛋白可以促进链球菌的杀伤［6］。SDS－PAGE 结 果 显 示，纯 化 得 到 的 重 组SSU05＿0272蛋白大小在130kDa左右，而其理论的分子量是74．3kDa，这与之前的报道一致［7］。在重组表达纯化蛋白方面，虽然国内外有文献报道，但本研究采用了不同的纯化方式，得到了纯度更高的蛋白［8］。

猪链球菌在同BMEC细胞相互作用过程中，能诱发BMEC分泌细胞因子。Vadeboncoeur等发现猪链球菌与hBMEC的黏附能诱导产生IL－6、IL－8等促炎症因子，IL－6能介导多种免疫反应，在脑膜炎病人的脑脊液中含量升高，可能为猪链球菌诱导机体产生细胞因子从而改变BBB的通透性提供了前提条件［9］。IL－1β是一个重要的促炎症因子，在猪链球菌感染中表达上调。IL－1β在细菌性脑膜炎致病中有重要作用，其通过刺激其他细胞因子如IL－8，IL－6和 GM－CSF的产生来介导炎症反应，同时其还能上调细胞粘附分子ICAM－1和BBB的通透性［10］。Vanier等发现猪链球菌活菌能刺激pBMEC分泌IL－6和IL－8，这种刺激主要是同猪溶血素有关，但细胞壁成分也一定程度的有助于细胞刺激［11］。实时定量 PCR 显示，SSU05＿0272在体内的表达有明显的提高［12］，我们的研究显示，SSU05＿0272蛋白与人脑微血管内皮细胞作用后IL－6、IL－8、TNF－α、IL－1β表达上调，IL－12P40表达下调，这在国内外还未见报道，提示其可能与促炎症有关。

［1］Huang YT，Teng LJ，Ho SW，et al．Streptococcus suis infection［J］．Microbiol Immunol Infect 2005，38（5）：306－13．

［2］Lun ZR，Wang QP，Chen XG，et al．Streptococcus suis：an emerging zoonotic pathogen［J］．Lancet Infect Dis，2007，7（3）：201－9．

［3］Gottschalk M，Xu J，Calzas C，et al．Streptococcus suis：a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen［J］．Future Microbiol，2010，5（3）；371－391．

［4］Francesca Mandanici，Lidia G mez－Gasc n，et al．A surface protein of Streptococcus suis serotype 2identified by proteomics protects mice against infection［J］．Journal of proteomics，2010：2365－2369．

［5］Annika K，Sauli H，Vuokko L，et al．Identification of a Novel Streptococcaladhesin p（SadP）protein recognizing galactosy l－1 4－galactose－containing glycoconjugates［J］．J Biol vol，2011，286（45）；38854－38864．

［6］Geng H，Zhu L，Yuan Y，et al．Identification and characterization of novel immunogenic proteins of Streptococcus suis serotype 2［J］．J Proteome Res，2008，7：4132－42．

［7］Li Y，Martinez G，Gottschalk M，et al．Identification of a surface protein of Streptococcus suis and evaluation of its immunogenic and protective capacity in pigs［J］．Infect Immun，2006，74：305－312．

［8］律清宇，陈哲，郑玉玲，等．2型猪链球菌细胞壁蛋白SSU1664的表达、纯化及活性分析［J］．细胞与分子免疫学杂志，2011，27（7）：757－759．

［9］Vadeboncoeur N，Segura M，Al－Numani D，et al．Pro－inflammatory cytokine and chemokine release by human brain microvascular endothelial cells stimulated by Streptococcus suis serotype 2［J］．FEMS Immunol Med Microbiol，2003，35（1）；49－58．

［10］Leib SL，Tauber MG．Pathogenesis of bacterial meningitis［J］．Infect Dis Clin North Am，1999Sep，13（3）；527－48，v－vi．

［11］Vanier G，Segura M，Lecours MP，et al．Porcine brain microvascular endothelial cell－derived interleukin－8is first induced and then degraded by Streptococcus suis［J］．Microb Pathog，2009，46（3）：135－43．

［12］Chen B，Zhang A，Li R，et al．Evaluation of the protective efficacy of a newly identifed immunogenic protein，HP0272，of Streptococcus suis［J］．FEMS Microbiol Letters，2010，1：1－7．