赤芍、白芍凉血作用比较研究(Ⅰ)-LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞的作用研究

宋玉超 连超杰 崔秀荣 李 强* 雷海民

（北京中医药大学中药学院，北京 100102）

赤芍、白芍凉血作用比较研究(Ⅰ)-LPS刺激大鼠肺泡巨噬细胞的作用研究

宋玉超 连超杰 崔秀荣 李 强* 雷海民

（北京中医药大学中药学院，北京 100102）

目的 观察赤芍、白芍各醇提物对脂多糖（LPS）致大鼠肺泡巨噬细胞（NR8383）不同时间段活性的影响，比较赤芍、白芍各醇提物的凉血作用的异同。方法 采用四甲基偶氮唑盐比色 （MTT）法检测LPS（1μg/mL）对NR8383细胞不同时间点的抑制率及赤芍、白芍（10μg/mL）对LPS诱导NR8383活性的调节作用。结果 1μg/mLLPS刺激NR8383 6h之前抑制率为负值之后逐渐转为正值，即先诱导其过度激活后促进其凋亡；观察到川赤芍、赤芍、白芍给药组能够在3h时显著抑制NR8383的过度活化，与LPS对照组比较具有显著差异（P＜0.05）；24h时各药物组均能够显著抑制NR8383的异常凋亡，与LPS对照组比较具有显著差异（P＜0.05）；24h时川赤芍、赤芍组与白芍组之间有显著差异（P＜0.05）。结论 赤芍、白芍是在共同具有凉血功效的前提下有所偏重。

赤芍；白芍；脂多糖；大鼠肺泡巨噬细胞；细胞抑制率

2010年版《中国药典》规定[1]：赤芍为毛茛科植物芍药Peaonia lacti fl ora Pall.或川赤芍Peaonia Veitchii Lynch的干燥根，白芍为毛茛科植物芍药Peaonia lactiflora Pall.经去皮水煮后的干燥根。本实验为赤芍、白芍比较研究的一部分，观察赤芍、白芍对LPS刺激NR8383不同时间段细胞活性的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材

川赤芍、赤芍、白芍均为自购，经北京中医药大学刘春生教授鉴定：川赤芍为毛茛科植物川赤芍Peaonia Veitchii Lynch的干燥根，赤芍、白芍分别为毛茛科植物芍药Peaonia lacti fl ora Pall.未去皮和经去皮水煮后的干燥根。

1.1.2 细胞

大鼠肺泡巨噬细胞系（NR8383）购于中国科学院细胞库，由本室传代后使用。

1.1.3 试剂

LPS（sigma，D127：B8，L3129-10mg，LOT NO.：020M4062）；F12K培养基（GIBCO，500mL，LOT NO.：979454），双抗（Hyclone，100mL，LOT NO.：J110981）和胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，100mL，LOT NO.：100419）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Amresco，50mg）；DMSO（Amresco，500mL，LOT#0640C354）

1.2 方法

1.2.1 川赤芍、赤芍、白芍醇提物的制备：将川赤芍、赤芍、白芍的干燥根粉碎，精密称取25 g粉碎后的药材，分别用8倍量70%乙醇加热回流提取2次，每次2h，合并药液，减压浓缩干燥。精密称取各提取物干粉100mg置10mL容量瓶中，加PBS稀释至刻度，配成10mg/mL的原药浓度，4℃保存备用，即得川赤芍醇提物、赤芍醇提物、白芍醇提物。

1.2.2 细胞培养：NR8383细胞培养于含15%胎牛血清、青霉素（1×105U/L）、链霉素（100mg/L）、L-谷胺酰胺（2 mmol/L）、NaHCO3（1.5g/L）的Ham’s F12K培养基中，置于37℃，5%CO2培养箱中。

1.2.3 LPS对NR8383细胞活性分析：待NR8383细胞生长状态良好时，吹打消化细胞，用培养液调整细胞浓度至1×105个/mL，将该细胞液加入96孔板中，200μL/孔，每组设6个复孔。培养24h后给予LPS溶液（LPS溶于PBS，终浓度分别为1μg/mL），正常细胞对照组加PBS。作用1h、3h、6h、12h、24h、36h后，每孔加入MTT 20μL，继续培养4h，吸尽液体后每孔再加入DMSO溶解液150μL，震摇5min，待紫色结晶全部溶解后，酶联免疫检测仪测A570值，计算LPS对NR8383的抑制率。

1.2.4 川赤芍、赤芍、白芍醇提物对LPS致NR8383细胞活性作用分析：细胞铺板同1.2.3所示。实验设川赤芍、赤芍、白芍醇提物 （终浓度为10μg/mL）组，孵育1h，再加入LPS（1μg/mL）。同时设正常细胞对照（不用LPS刺激）组、LPS对照（LPS刺激后加入PBS）组。培养1h、3h、24h后，MTT法检测A570值，计算各给药组及LPS组对NR8383的抑制率。各组实验均重复3次。

1.2.5 统计学方法：实验数据采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析，多组间差异采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间比较采用S-N-K检验分析，结果用（±s）表示，P＜0.05为有显著性差异，细胞抑制率（%）=1-药物组/正常细胞对照组，设正常对照组抑制率为0%。

2 结 果

2.1 LPS对NR8383细胞活性作用分析结果

MTT法检测的结果显示，1μg/mLLPS刺激NR8383细胞后，在不同时间段呈现出截然相反的作用。即6h之前起到诱导NR8383细胞持续过度激活的作用，而6h之后却又显著地抑制其增殖，LPS对NR8383的抑制率24h达到最大值，之后有所降低，这与LPS对其损伤是可逆的相一致。LPS对NR8383抑制率结果见图1。

图1 MTT法检测LPS对NR8383的抑制率

2.2 赤芍、白芍醇提取物对LPS所致NR8383细胞增殖作用结果

MTT法检测的结果显示，川赤芍醇提物、赤芍醇提物、白芍醇提物组作用1h时，三组均不能拮抗LPS诱导NR8383过度活化，与对照组比较均无显著差异（P＞0.05）；随着作用时间的延长，至3h时川赤芍醇提物、赤芍醇提物、白芍醇提物组都表现出拮抗作用，与LPS对照组比较均有显著差异（P＜0.05），但三组之间无显著差异（P＞0.05），这说明三者的作用效果相近；24 h时川赤芍醇提物、赤芍醇提物、白芍醇提物组能够拮抗LPS诱导NR8383过度凋亡，与LPS对照组比较均有显著差异（P＜0.05）。同时，川赤芍组、赤芍组与白芍组之间也存在差异（P＜0.05），这说明白芍组作用效果较川赤芍、赤芍稍弱。而川赤芍组与赤芍组之间无差异（P＞0.05）。结果见图2。

3 讨 论

图2 MTT法检测川赤芍、赤芍、白芍醇提物组及LPS组对NR8383的抑制率

赤芍、白芍均具有活血化瘀的作用，但是“白补而赤泻，白收而赤散”的理论使得二者在临床上各自为药，不可混用。然而从药材基源看，明清之前，医药学家多以花和根的颜色来加以区别—花、根色白者谓之白芍，赤者谓之赤芍，可谓基源不清。当代药典中二者的基源也有相互交叉的部分，而且目前质量标准不足以体现二者在功效上的差异。需药效实验补捉到功效成分的差异后,通过进一步研究确定功效成分组,进而有区别的制定质量标准,保证临床与生产用药的质量。赤芍长于凉血，白芍长于补血，故二者的功效差异主要体现在凉血和补血两个方面。其中赤芍、白芍补血作用的比较研究已另文发表[2,3]。本课题则从凉血方面入手。

根据温病卫气营血的理论体系，温病血分证是指温邪深入血分，引起耗血动血，瘀热互结所出现的证候[4]，其多发生于多种急性感染性和传染性疾病的危重阶段，而急性肺损伤（ALI）是此阶段最易出现的一种并发症。ALI发病机制复杂，至今尚未完全阐明。但是，诸多组织学及病理学研究表明，早期过度的宿主应答反应和后期免疫细胞的异常凋亡是介导ALI病理损伤的关键原因[5,6]。中医对此则认为热毒深入血分，迫血妄行是导致进一步血分证其它病变的原始动因，治疗应首当立足于清热凉血。由此可见，中医凉血的治法应当与机体的免疫异常密切相关。

肺泡巨噬细胞在ALI的发生、发展及转归的免疫反应中占有重要地位[7]。鉴于此本课题选择大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞炎性损伤模型，观察LPS对大鼠肺泡巨噬细胞NR8383细胞活性的影响及赤芍、白芍对LPS致NR8383细胞活性改变的作用。实验结果表明，肺泡巨噬细胞受LPS刺激后，首先过度持续活化表现在抑制率为负值，3h达到峰值，而后逐渐减缓6h后逐渐转为快速凋亡，这与介导ALI病理损伤的过程是一致的，进一步表明了肺泡巨噬细胞早期过度的应答以及后期异常的凋亡是导致肺组织细胞损伤的关键。在这一过程中，赤芍、川赤芍与白芍早期能够抑制LPS诱导的肺泡巨噬细胞的过度激活，防止引起呼吸爆发；后期又能够减少肺泡巨噬细胞的凋亡，起到保护肺损伤的作用。说明三者均对LPS诱导NR8383细胞活性的变化起到双向调节免疫反应、维持稳态的作用。但是，在LPS诱导后期，川赤芍、赤芍的作用明显优于白芍，这说明二者在凉血方面确有差异，是在共同具有凉血功效的前提下有所偏重。由此可见，今虽已有“白补赤泻”的择药趋向，但二者在凉血方面是具有共同的物质基础的，在临床上应可以交叉互换，这可通过以后的“功效成分组”的研究加以进一步验证。

（致谢：感谢北京中医药大学中药学院刘勇老师在实验期间给予的大力支持。本实验受北京中医药大学科研创新团队项目资助）

[1] 中国国家药典委员会.中国药典(一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:96.

[2] 李强,周荣,杨伟鹏,等.赤芍、白芍补血作用比较研究(Ⅰ)[J].中医药信息,2010,27(6):11-13.

[3] 李强,周荣,杨伟鹏,等.赤芍、白芍对环磷酰胺所致的血虚证小鼠补血作用比较研究[J].中医药信息,2011,28(1):19-21.

[4] 林培政.温病学[M].北京:中国中医药出版社,2003:21.

[5] 吕进,王希良.流感病毒感染介导的免疫病理损伤研究进展[J].生物化学与生物物理进展,2009,36(8):961-967.

[6] Kitsmura Y,Hashimoto S,Mizuta N,et al.FasPFasL-dependent apoptosis of alveolar cells after lipopolysaccharide-induced lung injury in mice[J].Am J Respir Crit Care Med,2001,163( 3Pt1):762-769.

[7] 张伟,蒋耀光,李磊.肺泡巨噬细胞与急性肺损伤[J].创伤外科杂志,2003,5(5):389-391.

A Comparative Study on Content of Cooling Blood between Radix Paeoniae Rubra and Radix Paeoniae Alba (Ⅰ) -Study on LPSstimulatedRat Alveolar Macrophages

SONG Yu-chao, LIAN Chao-jie, CUI Xiu-rong, LI Qiang*, LEI Hai-min
(Chinese Medicine College, Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

ObjectiveTo study the effects of white peony roots and red peony roots on alveolar macrophages (NR8383) treated by LPS, comparing differences of blood-cooling between them.MethodMTT assay was used to detect the inhibitory rate of NR8383 induced by LPS at the different time and the role of white peony roots and red peony roots to the NR8383 induced by LPS.ResultFirstly, NR8383 cells were activated, and then were inhabited by LPS.White peony roots and Red peony roots can adjust the balance of NR8383 induced between activation and apoptosis.However, the role of red peony roots in the late time are much better than white peony roots.ConclusionThere are some differences between white peony roots and red peony roots under the common pharmacodynamic basis of blood-cooling.

Red peony roots; White peony roots; Lipopolysaccharide; Rat alveolar macrophages; Cell inhibitory rate

R282.05

B

1671-8194（2012）15-0004-03

10.15912/j.cnki.gocm.2012.15.653

*通讯作者