实验动物肝组织石蜡切片制作中易发问题探讨

柏美玲 宋昱 林群凡 邓爽 胡少青 伍义行

石蜡切片是组织病理学制片技术中最为常用的方法，广泛应用于临床诊断和科研教学中。石蜡切片制作涉及取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色、封片等系列步骤，影响因素众多，且不同组织类型具有不同的特点，每个操作环节的失误都将影响切片的最终质量［1］。肝组织具有细胞成分较多、细胞间隙较大、纤维结缔组织较少、质地较脆等特点，肝组织蜡块在切片时易碎裂，染色后常呈脱水和透明过度的表现(如出现大量裂纹等)，从而影响肝组织原始形态结构的观察和结果的判断。而实验动物肝组织石蜡切片在肝病研究、抗肝炎药物药效评价、新药毒理学评价和组织病理教学中起到了十分重要的作用。因此，本文结合自己的研究经验，重点对常见实验动物(大、小鼠)肝组织石蜡切片制作的特点和常见问题进行了分析总结，并提出了相应的解决方法。

1 取材

取材组织面积一般为1.5 cm×1.5 cm，厚度不超过0.3 cm，组织太大或过厚时均可降低脱水效果。取大小鼠肝组织时，应先进行放血处理，再解剖取肝组织，以防止肝组织内积血，影响切片效果。因肝组织属于脆弱器官，应小心使用镊子的弯月面移动或夹取器官，防止镊子尖端损伤肝组织造成人为破坏。

2 固定

固定的目的在于保存组织内细胞原有的结构和形态。石蜡切片常用固定液有甲醛、乙醇、醋酸、AF液(乙醇+甲醛液)、AAF液(醋酸+乙醇+甲醛液)等，需根据实验材料的性质及制片目的不同，选用适宜的固定液［2］。肝组织切片制作常选择福尔马林作为固定液，因其对肝组织具有较强的穿透力，可有效抑制溶酶体酶对肝组织的自溶和细菌的繁殖，保护正常的形态结构。切取标本后应尽快将标本置于盛有足够固定液的容器内固定，以确保细胞形态上的原始性，防止组织死后自溶而产生变化［3］。固定液应以新配为好，选用福尔马林固定肝组织时间应不少于4 h，不大于48 h。此外，也可采用微波处理法固定组织［4］。

3 脱水

脱水的目的是采用脱水剂将组织内的水份置换出来，以利于有机溶剂的渗入。常用脱水剂是酒精，而正丁醇、叔丁醇、丙酮及二氧六环等也可做脱水剂。动物肝组织常选用乙醇作为脱水剂，其优点是比较温和，对组织伤害比较小。肝组织也可选用正丁醇脱水，其优点是可省去二甲苯透明直接浸蜡而缩短制作时间，且不会引起组织块过度收缩，但易出现脱水不足的现象［5］。另外将正丁醇与乙醇按比例混合后作脱水剂效果也较好。脱水剂使用一段时间后，试剂挥发或者混杂其它杂质会引起浓度降低，均影响组织脱水效果［6］。因此，脱水剂要定期更换，更换时最好用比重计测量各级酒精的浓度［7］。此外，还应注意:①脱水应逐步进行，顺序颠倒会极大影响脱水效果;②在无水乙醇中不得放置时间过长，否则会引起组织块过度硬化，导致切片时组织破碎;③更换脱水剂时，浸泡时间需减去吸水过程中所耽误的时间，以免脱水不足;④脱水必须在有盖的玻璃瓶中进行，防止吸收空气中的水分和酒精挥发，保证脱水彻底。

4 透明

透明剂可替换出组织内的乙醇，使石蜡顺利地渗入组织中，增强组织的折光系数从而出现透明状态。常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁醇、香柏油等。动物肝组织常选用二甲苯作透明剂，因二甲苯对神经的麻醉作用及粘膜的刺激性，使用时应尽量在通风橱内进行，也可用硬脂酸石蜡混合液代替二甲苯透明［8］。由于二甲苯对组织的收缩性强，作用迅速，故组织在二甲苯中时间不宜过长，否则组织容易变脆变硬。透明剂的浸渍时间要根据组织材料块大小及性质而定。如果透明时间过短，则透明不彻底，石蜡难于浸入组织;透明时间过长，则组织硬化变脆，不易切出完整切片。动物肝组织若选用二甲苯为透明剂，可分为三阶段(二甲苯Ⅰ20 min，二甲苯Ⅱ10 min，二甲苯Ⅲ10 min)进行。二甲苯应定期更换，以免挥发或吸湿造成浓度改变，影响透明的程度。此外，如果透明时组织周围出现白色雾状，说明材料中的水份未被脱净，应退回重新脱水后再透明。

5 包埋

包埋是标本经脱水后浸入包埋剂，并使之渗透进入标本本体的过程。石蜡是常用的包埋剂，包埋用石蜡应与浸蜡用石蜡熔点一致，并且与样品硬度相近。透蜡温度要恒定，模具、样品和石蜡之间温差要一致，以保障石蜡充分包围并支撑样品。为了防止组织未包埋完就已凝固，故包埋温度要略高，但温度过高会导致组织收缩变硬变脆，不利于切片［9］。此外，新购腊块可经多次反复加热，使其包含的气体蒸发。在包埋之前可用高温将石蜡融化，再降低至需要的温度，温度一般比石蜡熔点高5℃ ～6℃即可。动物肝组织包埋温度为62℃时效果较好。包埋操作要迅速，力求在最短时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等［10］。浸蜡时间不宜过长，否则易造成组织块脆硬，切片如豆腐渣样。包埋后石蜡的迅速冷却，可防止包埋块中产生结晶以致切片碎裂等现象发生［11］。

6 染色

标本经石蜡包埋后切成4～5 μm厚的薄片，再经脱蜡后进行染色。苏木素-伊红染色法是石蜡切片常用的染色法之一，伊红作为对比染色剂不应染得太红，以免细胞核与细胞质难以区分，故染色时间不能太长;但也不能染得太淡，否则细胞质着色不完全，细胞质和细胞核红蓝对比不明显，故染色时间也不能太短［12］。此外，染色还需注意:①加温染色时温度不应太高，过高则会使物理染色性增强，肝组织选择50℃、染色5 min效果较好;②染色试剂应及时更换，避免有效成分减少;③分化时操作应在镜下控制核的染色，防止分化液不起作用;④染色过程中所用乙醇、二甲苯等试剂常有染色剂混入影响染色效果，应定期更换避免染色剂的污染。染色结束进行封片，封片时中性树胶滴加要适量，太少或过稀时均易出现空泡。封片后即可保存或在显微镜下观察。综上所述，组织切片质量的优劣，直接影响结果的判断，而制作高质量的切片需要长期的摸索和改进。由于肝组织固有的特点，肝组织蜡块在切片时较脆易碎，染色后镜下结构常呈现断裂现象，影响了肝组织原始结构的观察。因此，不断地分析总结肝组织石蜡切片制作的特点，探索肝组织制片的新技术和新方法，提高肝组织切片制作水平，对教学科研和临床诊断工作具有重要意义。

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