红色荧光蛋白在酿酒酵母中的表达特性研究

史彦薇，王志芳，王伟，安建梅，孔建强

红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)是从珊瑚纲生物中分离出来的一类与绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）同源的荧光蛋白，其在紫外光的照射下可发射红色荧光[1]。自 1999年首次被分离出来至今，红色荧光蛋白以其激发和发射波长较长、细胞内成像背景低、细胞毒性小而备受关注并广泛应用。迄今为止，红色荧光蛋白已经拥有多种突变体[2-10]，与最初的红色荧光蛋白相比，突变体红色荧光蛋白在成熟时间、荧光强度、发射波长以及聚集程度方面均有很大改观，同时更多成熟时间短[2-4]、荧光强度强[5-7]、发射波长更长的单体红色荧光蛋白[8-10]也得以成功开发应用。不仅如此，红色荧光蛋白性能的改善还使其更多地被用于分子标签[11-13]以及蛋白相互作用[14-16]的研究。为了更好地拓宽红色荧光蛋白的应用领域，本实验尝试将红色荧光蛋白 Dsred 基因导入酿酒酵母菌，实现红色荧光蛋白在酿酒酵母菌体内的异源表达；同时为缩短红色荧光蛋白的成熟时间，对缺水环境中红色荧光蛋白的表达特性进行了分析，以期为红色荧光蛋白更好地应用于双分子荧光互补（bimolecular fluorescent complementary，BiFC）[14-16]等蛋白互作技术研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株 大肠杆菌菌株 E.coli TG1 和酿酒酵母菌株 W303-1B（MATa；ade2-1；his3-11,his3-15；leu2-3, leu2-112；ura3-1；trp1-1）均为本实验室保存；pMD18-T 载体购自宝生物工程（大连）有限公司；pYeDP60 酿酒酵母表达载体为法国Werck-Reichhart 教授馈赠。

1.1.2 试剂与仪器 KOD Plus 高保真 DNA 聚合酶购自日本 Toyobo 公司；鲑鱼精 DNA 购自日本 Wako 公司；聚乙二醇（PEG4000）购自北京欣经科生物技术有限公司；醋酸锂和伴刀豆球蛋白购自美国 Sigma 公司；酵母质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；快速连接试剂盒 In-fusionTMAdvantage PCR Cloning Kit/Cloning Enhancer Kit 购自美国 Clontech 公司；蛋白Marker 购自立陶宛 Fermentas 公司；其他试剂均为分析纯。

LB 大肠杆菌培养基（含 10 g/L 胰蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L NaCl；固体培养基添加1.5% 琼脂粉）购自德国 Merck 公司；YPD 酵母培养基（含 10 g/L 酵母提取物、20 g/L 细菌蛋白胨、20 g/L 葡萄糖；固体培养基添加 2% 琼脂粉）和 YPG 酵母诱导培养基（含 10 g/L 酵母提取物、20 g/L 细菌蛋白胨、20 g/L 半乳糖）购自英国Oxoid 公司；SCD 酵母胁迫培养基（含 7 g/L 无氨基酵母氮源、2 g/L drop-out 混合物、20 g/L 葡萄糖；固体培养基添加 2% 琼脂粉）、SCG 酵母胁迫诱导培养基（含 7 g/L 无氨基酵母氮源、2 g/L drop-out混合物、20 g/L 半乳糖）和 SC-Ade-Ura 培养基购自北京欣经科生物技术有限公司。

Eclipse 80i 正置荧光显微镜为日本 Nikon 公司产品；Spectra Max190 酶标仪为美国 MD 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 Dsred 基因的克隆 采用连续重叠 PCR方法快速克隆 Dsred 基因[17]。根据已经发表的Dsred 基因的序列（GenBank：DQ005468）设计 8对引物（表 1）。在 8 对引物中，除 Fyedp60Red 和Ryedp60Red 之外，每条引物全长均为 59 nt（nucleotide，核苷酸），其中包括14 nt的重叠序列。所有引物均由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

首先，以 Fred1 和 Rred1 互为模板，采用重叠 PCR 方法扩增获得 Dsred 基因初始序列，PCR扩增反应体系总体积为 50 μl，含 dNTP（2 mmol/L）5 μl、KOD Plus buffer 5 μl、KOD Plus 聚合酶 1 μl、Fred1 和 Rred1 各 1μl、MgSO4（25 mmol/L）2 μl、水 35 μl。然后，以该初始序列为模板，通过连续重叠 PCR 方法合成全长 Dsred 基因，扩增循环参数：98 ℃ 10 s；98 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 个循环；72 ℃ 7 min。反应完毕，取 PCR 扩增产物行 0.8% 琼脂糖凝胶电泳分析。

表 1 PCR引物序列Table 1 Sequence of PCR primers

将扩增获得的全长 Dsred 基因与 pMD-18T载体分别经 BamH I、EcoR I 双酶切后，以 T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化 E.coli TG1，筛选、挑取阳性克隆培养，进行测序鉴定，序列鉴定正确的重组载体命名为 pMD-Dsred。

1.2.2 重组表达载体的构建 以 Fyedp60Red/Ryedp60Red 为引物（表 1），采用连续重叠 PCR方法扩增得到一条长约为 700 bp 的序列，将该序列通过In-fusion 方式连接到经 BamH I、EcoR I 双酶切的载体pYeDP60 中，获得含全长 Dsred 基因的 pYeDP60-Dsred 重组酿酒酵母表达载体，并进行测序鉴定。载体构建过程实验步骤参考快速连接试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 重组表达载体的转化和诱导表达 采用LiAc 法[17]将测序鉴定正确的 pYeDP60-Dsred 重组表达载体转化至酿酒酵母菌 W303-1B，取转化产物涂布在固体 SC-Ade-Ura 培养基上，28 ℃ 培养 3 ～ 4 d 后，挑取 3 个转化子分别接种至 10 ml液体 SC-Ade-Ura 培养基，28 ℃ 培养 2 ～ 3 d。取3 ml 菌液，利用酵母质粒提取试剂盒提取质粒，以提取质粒为模板，Fyedp60Red、Ryedp60Red 为上下游引物，进行 PCR 扩增筛选阳性克隆，获得的阳性克隆命名为 W303B[pYeDP60-Dsred]。

挑取阳性克隆接种至 10 ml 液体 SC-Ade-Ura培养基，28 ℃ 培养 2 ～ 3 d 后，取 1 ml 菌液转接至 50 ml 新鲜的液体YPG酵母诱导培养基中，28 ℃ 诱导 24 h。取 1 ml 样品，同时以转化入pYeDP60 空载体的重组菌株 W303B[pYeDP60]作为空白对照，12 000 × g 离心 1 min，弃上清，取沉淀进行 SDS-PAGE 电泳。

1.2.4 表达产物鉴定 取诱导表达 24 h 的 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌，12 000 × g 离心 1 min后收集菌体，去离子水洗涤 1 次后加入伴刀豆球蛋白（1 mg/ml）悬浮，涂于载玻片上，在 Eclipse 80i正置荧光显微镜下观察绿光激发后的荧光成像。

1.2.5 重组蛋白对酿酒酵母生长的影响 将鉴定正确的 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌分别接种至 YPD、YPG、SCG、SCD 培养基，培养 48、72、96、120、144 h 后分别取样，利用酶标仪测定波长600 nm 处酵母菌细胞的吸光度（A600）值，观察重组 Dsred 蛋白对酿酒酵母菌生长的影响。

1.2.6 重组蛋白表达特性的分析 取诱导表达24 h 的 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌液 15 ml，分装入 15 管，每管 1 ml。实验分 3 组，每组5 管，分别进行如下处理：第 1 组保持菌液状态（菌液组）；第 2 组 12 000 × g 离心 1 min 后收集菌体，加入甘油后混悬（高渗组）；第 3 组12 000 × g 离心 1 min 后收集菌体（菌体组）。处理后将每组 5 管分别置于 –70、–20、4、28、37 ℃条件培养，每 24 h 取样 1 次进行荧光观察。

2 结果

2.1 Dsred基因克隆

连续重叠 PCR 扩增产物经 0.8% 琼脂糖凝胶电泳分析，结果获得长为 678 bp 的特异性条带（图 1）。将扩增产物与 pMD-18T 连接，获得的pMD-Dsred 重组载体测序结果表明，扩增获得的

图 1 Dsred 基因连续重叠 PCR 扩增结果Figure 1 The successive overlap PCR products of Dsred gene

图 2 pYeDP60-Dsred 重组表达载体图谱Figure 2 Map of recombinant expression vector pYeDP60-Dsred

图 3 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌 PCR 扩增筛选结果Figure 3 PCR amplification screening of the engineered strain W303B[pYeDP60-Dsred]

Dsred 基因与已经发表的基因序列完全一致。

2.2 重组表达载体的构建

采用 In-fusion 方法快速连接获得的 pYeDP60-Dsred 重组表达载体经测序鉴定显示，克隆的Dsred 基因序列完全正确，表明目标基因已成功插入重组表达载体，且 Dsred 基因表达受酵母诱导型启动子 GAL10-CYC1 调控，与理论设计完全相符（图 2）。

2.3 工程菌的筛选与诱导表达

将 pYeDP60-Dsred 重组表达载体转化至酿酒酵母菌 W303-1B 后进行扩大培养，挑取 3 个克隆提取质粒进行 PCR 扩增，结果显示 3 个克隆均扩增获得了长为 700 bp 的特异性条带，表明挑取的 3 个克隆均为阳性克隆，含有 Dsred 基因（图 3）。

挑取阳性克隆进行诱导培养，SDS-PAGE 分析显示，诱导后工程菌的表达产物可见相对分子质量为 28 kD 的特异性蛋白条带，与预期蛋白相对分子质量相符（图 4）。

2.4 表达产物鉴定

图 4 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌诱导表达产物的SDS-PAGE 分析Figure 4 SDS-PAGE analysis of expression products of the engineered strain W303B[pYeDP60-Dsred]

W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌经诱导培养24 h 后置于荧光显微镜下观察，可见在绿光激发下，W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌被激发出红色荧光，表明构建的 pYeDP60-Dsred 重组表达载体可成功在酿酒酵母菌体内正常表达（图 5）。

2.5 重组蛋白对酿酒酵母菌的影响

将 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌分别接种至 SCG、SCD、YPG、YPD 培养基，培养 48 h 后连续测定 A600值，结果显示抑制 pYeDP60-Dsred表达的 SCD、YPD 培养基与可诱导 pYeDP60-Dsred 表达的 SCG、YPG 培养基内酿酒酵母菌体生长无明显差别（图 6），表明重组 Dsred 红色荧光蛋白表达对酿酒酵母菌体的生长影响很小，对酿酒酵母菌无毒性，不会抑制其生长。

2.6 高渗环境中重组蛋白的表达特性

W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌经不同处理后，荧光显微镜下连续观察各组红色荧光蛋白的表达成熟时间，结果显示在不同温度条件下，高渗组红色荧光蛋白的成熟时间均最短，菌液组时间最长，且持续时间较短。在 37 ℃ 条件下培养时红色荧光蛋白成熟最早，然而也最不稳定，荧光蛋白降解速度较快；在 4 ℃ 条件下培养时红色荧光蛋白成熟时间虽然迟于 37 ℃，但最稳定（表2）。

3 讨论

红色荧光蛋白是一种标记分子，由于其激发和发射波长更长，细胞穿透力更强以及细胞毒性小而被广泛应用到基因表达与调控[18-19]、分子标记[11-13]和蛋白相互作用[14-16]等领域。酿酒酵母菌是一种模式真核生物，以酿酒酵母菌为宿主的多种研究蛋白相互作用的技术，如酵母双杂交[20-21]和酵母双分子荧光互补技术[14-16]等也都已经建立成熟。为了更好地将红色荧光蛋白应用至酿酒酵母菌为宿主的技术中，我们对红色荧光蛋白在酿酒酵母菌内的异源表达进行了实验研究，SDS-PAGE 和荧光显微镜观察结果表明，pYeDP60-Dsred 重组表达载体已成功构建和转化，并可正常在酿酒酵母菌体内表达，为红色荧光蛋白的应用奠定理论基础。

图 5 W303B[pYeDP60-Dsred]工程菌重组Dsred红色荧光蛋白表达的荧光显微镜观察（A：W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌相差结果；B：W303B[pYeDP60-Dsred]工程菌绿色荧光激发结果；C：酿酒酵母菌W303B相差结果；D：酿酒酵母菌W303B绿色荧光激发结果）Figure 5 Fluorescent microscope images of recombinant Dsred red fluorescent protein expressed by the engineered strain W303B[pYeDP60-Dsred]. (A: Phase contrast image of the engineered strain W303B[pYeDP60-Dsred]; B: Image of the engineered strain W303B[pYeDP60-Dsred] excited by green fluorescence; C: Phase contrast image of Saccharomyces cerevisiae W303B; D:Image of Saccharomyces cerevisiae W303B excited by green fluorescence)

图 6 重组Dsred红色荧光蛋白对酿酒酵母菌生长的影响Figure 6 Effect of recombinant Dsred red fluorescent protein to Saccharomyces cerevisiae growth

表 2 不同条件下重组Dsred红色荧光蛋白的成熟时间Table 2 The mature time of recombinant Dsred red fluorescent protein treated with different conditions

为了进一步探究 pYeDP60-Dsred 重组表达载体对酿酒酵母菌生长的影响，我们将 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌分别接种至 SCG、SCD、YPG、YPD 培养基中进行连续培养观察。由于pYeDP60-Dsred 重组表达载体中 Dsred 基因受GAL10-CYC1 启动子调控表达，而 GAL10-CYC1启动子是一种半乳糖诱导、葡萄糖抑制型启动子，因此 SCG 和 YPG 培养基中 W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌在半乳糖的诱导下，可产生重组Dsred 蛋白；但作为对照，SCD 和 YPD 培养基中W303B[pYeDP60-Dsred] 工程菌表达则受到抑制，无法产生重组 Dsred 蛋白。本实验结果显示诱导表达的工程菌与抑制表达的工程菌生长情况基本一致，红色荧光蛋白表达对酿酒酵母菌体生长无明显影响。

高渗透压环境是酵母细胞在生长繁殖过程中经常遇到的胁迫现象之一，因此了解高渗透压环境下红色荧光蛋白在酿酒酵母菌内的表达特性具有重要意义。在长期的生物进化过程中，酵母逐步形成了抵抗外界胁迫环境的生理机制，即通过促进一种或多种特殊溶质（相容性溶质）在细胞内的累积从而调节细胞内渗透压的平衡。这些相容性溶质能在细胞内以高浓度存在而不对细胞内酶产生抑制或失活作用，甘油即为酿酒酵母菌和多种其他酵母菌细胞最主要的一种相容性溶质。本研究通过对菌液进行离心、加入甘油等处理，使酿酒酵母菌处于一种少水的高渗透环境中，结果表明高渗透压环境能够明显缩短酿酒酵母菌内红色荧光蛋白的成熟时间，并使其长期保持稳定。由此可得出结论，离心保留菌体和加入甘油等缺水处理都有利于红色荧光蛋白的成熟。

自从红色荧光蛋白被发现以后，各国科学家都通过对红色荧光蛋白进行体外分子进化，获得了多种成熟时间缩短的突变体，却很少有实验涉及探讨环境与成熟时间的关系。本实验通过研究红色荧光蛋白在高渗环境中的表达特性，证实除分子进化之外，通过改变红色荧光蛋白在宿主内所处的环境，也能显著地缩短其成熟时间，保持其稳定性，进一步拓宽了红色荧光蛋白在酿酒酵母菌研究领域的应用。

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