加味归脾汤对乳腺癌MDA-MB-435株抑制作用的研究＊

李晶哲，夏 芸，马琰岩，刘 红，吕俊海，刘柏东

(1.中国中医科学院医学实验中心，北京 100700;2.赛诺菲安万特(中国)公司，北京 100022)

乳腺癌是威胁妇女健康的主要恶性肿瘤，居女性易发恶性肿瘤之首。目前有许多方法如新药泰索帝、赫赛汀等和放射疗法促进癌细胞凋亡、抑制癌细胞转移等，帮助人类提高乳腺癌患者的生存率，但是放射和化学疗法带来的巨大副作用使许多患者难以承受，并丧失了治疗的机会。尤其对于雌激素受体(estrogen receptor，ER)阴性的乳腺癌患者，因为其高浸润性的特性且靶向ER药物无效，往往预后更差。中医认为，乳腺癌的主要病因和发病机制在于肝气郁结、冲任失调、毒热蕴结、气血两虚。中医治疗乳腺癌的原则主要为疏肝解郁、调补冲任、清热解毒、益气养血、健脾和胃等[1]。本文选用中药方剂为具有补气升阳、益卫固表等功效的加味归脾汤(《景岳全书》记载)，细胞为ER受体阴性的代表株MDA-MB-435株。以此对乳腺癌ER受体阴性的中医治疗做一研究，以明确该方剂对ER受体阴性乳腺癌产生的生物学作用。为便于今后发挥中药联合用药的优势，进一步研制出针对ER受体阴性乳腺癌有显著作用的新药。本文使用目前治疗乳腺癌的一线药物多西紫杉醇(Docetaxel)为阳性对照药，该药物主要作用于微管蛋白/微管系统，能促进微管聚合，使细胞分裂阻滞于G2/M期，最终导致细胞死亡。

1 材料

1.1 细胞株

人乳腺癌细胞株MDA-MB-435(ATCC)。

1.2 药品与试剂

加味归脾汤原料药(同仁堂);Docetaxel(Sanofi-Aventis);MTS(CellTiter 96RAQueous，Promega);细胞凋亡流式细胞检测试剂盒(BD);Caspase-8检测试剂盒(Promega);DMEM(GIBCO);胎牛血清(Hyclone)、细胞消化液(GIBCO)。

1.3 仪器设备

倒置显微镜(NIKON)、超净台(Heal Force)、细胞培养箱(Thermo)、酶标仪(Bio-RAD)、流式细胞仪(BD)。

2 方法

2.1 细胞培养

人乳腺癌细胞株MDA-MB-435使用DMEM(含10%胎牛血清)，于37℃5%CO2条件下培养。

2.2 药物分组

2.2.1 Docetaxel浓度 5μg/ml

2.2.2 加味归脾汤取人用方剂1剂(人参、黄芪、白术、茯苓、枣仁各 1 2 g，远志、当归、柴胡、山栀各6 g，木香、炙甘草各3 g)，煎煮2次，合并药液浓缩至标准药液量200 ml，灭菌后用细胞培养液按体积比配制为高浓度(10%)、中浓度(5%)、低浓度(2.5%)。

2.2.3 药物分组 Docetaxel组;加味归脾汤高浓度、中浓度、低浓度组;阴性对照组(不给药)。

2.3 抑制率检测

每24 h检测1次，连续检测72 h。MTS法依据试剂盒说明书操作。培养采用96孔细胞培养板(Coring，3599)，检测前小心移除培养液，加入CellTiter 96R Aqueous，37℃5%CO2条件下孵育1 h后酶标仪检测。计算公式为(1－OD给药÷OD阴性对照)×100%。

2.4 细胞凋亡流式细胞仪检测

检测第72小时的状态。采用AnnexinⅤ-FITC/PI标记，依据试剂盒说明书操作。收集细胞以PBS洗涤3遍，调整细胞浓度至3×105个/ml，标记染料后于黑暗处静置15 min，流式细胞仪分析。激发波长488 nm，发射波长530 nm。

2.5 Caspase-8检测

每24 h检测1次，连续检测72 h。依据试剂盒说明书操作，在405 nm处测定吸光度值，细胞浓度为3×106个/ml。

2.6 统计方法

数据统计使用SPSS11.5进行分析，数据以均值±标准差表示。采用t检验，P＜0.05为有显著差异。

3 结果

3.1 药物对细胞的抑制率

表1显示，中药各浓度组与其同时间的Docetaxel组比较。

表1 药物对细胞的抑制率

表1 药物对细胞的抑制率

注:与其同时间的Docetaxel组比较:*P＜0.05

药物组时间 Docetaxel 中药高浓度中药中浓度中药低浓度阴性对照组24 h 30.5±3.76 23.2±2.29* 10.3±2.61* 3.2±1.15*0 48 h 57.2±5.22 62.7±3.98* 30.3±4.21* 13.6±3.42* 0 72 h 75.6±5.18 75.2±6.12 41.5±5.37* 24.6±3.39*0

3.2 流式细胞检测细胞凋亡

图1显示，中药组诱导多为晚期凋亡，中药高浓度组晚期凋亡数量较多为85.9%。随中药剂量的降低，中药中浓度和低浓度组正常细胞数逐渐增多，晚期凋亡细胞数逐渐减少。中药中浓度组为38.7%，中药低浓度组为25.3%，流式细胞检测结果与MTS检测结果基本相符。

3.3 Caspase-8检测

表2显示，中药各浓度组与其同时间的Docetaxel组比较。

表2 Caspase-8表达量统计

表2 Caspase-8表达量统计

注:与其同时间的Docetaxel组比较:*P＜0.05

药物组时间 Docetaxel 中药高浓度 中药中浓度 中药低浓度 阴性对照组24 h 0.677±0.029 0.513±0.025* 0.383±0.011* 0.201±0.011*0.062±0.008 48 h 0.782±0.032 0.829±0.035* 0.492±0.023* 0.252±0.018* 0.071±0.011 72 h 0.463±0.028 0.561±0.023* 0.235±0.016* 0.171±0.007*0.079±0.010

图1 流式细胞仪检测结果

4 讨论

本实验结果表明，中药方剂加味归脾汤对乳腺癌细胞ER受体阴性代表株MDA-MB-435抑制作用明显，且经流式细胞仪检测多为诱导晚期凋亡。与对照药物Docetaxel相比，高浓度中药作用效果与用于乳腺癌一线治疗的药物相当。

设法促进肿瘤细胞凋亡，调控肿瘤细胞的凋亡诱导分子的表达，使其恢复对凋亡诱导的敏感性是肿瘤治疗的策略之一。半胱酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinylaspanate specific protease，Caspase)是一类与细胞凋亡密切相关的蛋白水解酶。根据在细胞凋亡机制中的作用，Caspase家族主要有细胞凋亡启动作用和细胞凋亡执行作用两类功能[2、3]。凋亡启动作用的Caspase分子在外来蛋白信号的作用下被切割激活后，对凋亡执行作用的Caspase进行切割并使之激活，使Caspase靶蛋白水解，导致细胞程序性死亡。Caspase-8通过寡聚而自身切割活化，并激活下游半胱氨酸蛋白酶，产生不可逆凋亡作用[4、5]。Caspase-8主要起着发起者作用，它是死亡受体通路的关键蛋白酶，当细胞受到各种凋亡因素的刺激时，可使死亡配体(TNFα、Fas、TRAIL)和相应的死亡受体相结合，引起上游的Caspase-8活化，活化的Caspase-8能激活如Caspase-3等下游Caspase。被激活后可引起下游Caspase“瀑布式”激活，且可将凋亡信号从非依赖线粒体途径传递到线粒体途径，把死亡受体通路和线粒体通路联系起来，放大凋亡信号[6、7]。加味归脾汤可以诱导Caspase-8高表达，可以初步确定其抗肿瘤原理与死亡受体途径相关。

我国临床各类中、晚期癌症患者多用扶正固本方剂，这种方剂对提高患者近期、远期疗效都有益处。各种治疗乳腺癌的方剂中祛瘀扶正的药物为必用之物[8]。中药辨证施治用药的精华是调节人体内环境，它的作用是多靶点、多部位、多途径、多效应的，作用机制异常复杂。本文从其中1个方面对1剂治疗乳腺癌的方剂进行研究，在实验过程中初步检测到该方剂与现在正在使用的西药一线药物作用相当，而中药的毒副作用和价格能使广大患者更容易接受。对于该中药复方的研究还将继续从其他方面进行，最终确定整体药效学，为肿瘤临床开发出生物活性高且低毒的新型药物提供参考。

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[4]Zhang W，Shi HY，Zhang M.Maspin overexpression modulates tumor cell apoptosis through the regulation of Bcl-2 family proteins[J].BMC Cancer，2005，5(1):50.

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[8]山广志，叶兴涛.注射用黄芪多糖联合化疗治疗84例晚期恶性肿瘤临床疗效观察[J].中国肿瘤临床，2007，34(6):355-356.