大鼠血管生成素-2在脓毒症型急性肺损伤中的变化

钱知勉，张丽丹 ，冯国营，殷彦君，余献丹

(1.乐清市第三人民医院 呼吸与心血管科，浙江 乐清 325604；2. 滨州医学院 基础学院，山东 滨州 256603)

急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是指心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性、进行性、缺氧性呼吸衰竭，PaO2/FiO2比值≤300,但>200，其余指标与急性呼吸窘迫综合征(ARDS)相同[1]。脓毒症引起的急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)、脓毒性休克及多器官功能障碍综合征(MODS)是其重要致死原因[2]。促血管生成素(Ang)是一类由血管内皮周围细胞分泌的糖蛋白，包括Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4[3]。其中，Ang-2由血管内皮细胞合成并储存于内皮细胞，内皮细胞受刺激后Ang-2可被快速释放，Ang-2与Tie-2(一类具有较高同源性的受体酪氨酸激酶)结合，发挥生物学效应，过表达可破坏血管形成，导致血管通透性增高，在急性血管反应如ALI中有重要作用。本研究通过盲肠结扎穿孔术诱导脓毒症制作SD大鼠ALI模型，对SD大鼠ALI中肺组织变化和血清Ang-2水平进行研究，并探讨其相互关系及影响，为防治ALI提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及试剂

成年雄性SD大鼠45只,体重200～250 g(滨州医学院实验动物中心提供)，随机分为两组，对照组10只，实验组35只。大鼠血管生成素2(Ang-2)ELISA试剂盒，购自美国ADL公司。

1.2 模型制备

实验组ALI模型制备：术前大鼠禁食12 h，禁水8 h，3%水合氯醛行腹腔麻醉，75%乙醇消毒腹部，沿腹白线中段作一长1.5 cm的切口,剪开皮肤和肌层，探查腹腔分离盲肠，在距盲肠末端1 cm处用3-0丝线结扎盲肠，注意避免结扎盲肠动脉及引起肠梗阻，用16 G穿刺针在盲肠游离面(肠系膜对面)上贯穿3次，针孔间距约3 mm，并挤出少许内容物，还纳肠管。术毕逐层关腹，并于腹壁皮下注射林格液3 mL /100 g抗休克处理。术后自由进食饮水。对照组假手术处理，仅做无菌开腹与盲肠翻动。实验组存活23只，死亡12只，存活率65.7%。

1.3 标本处理

分别于假手术及盲肠结扎穿孔术后24 h处死全部大鼠，剪取肺组织，常规石蜡包埋，HE染色观察肺部病理变化，用酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清Ang-2水平，具体步骤按试剂盒说明操作。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 肺组织变化

对照组SD大鼠肺脏光镜下肺组织结构清楚，肺泡腔清晰,肺泡隔基本无水肿、炎症等特殊改变；实验组光镜下见部分肺泡萎陷，肺泡壁通透性增加，可见较多中性粒细胞及少许巨噬细胞浸润，肺泡间隔增宽等(图1、2)。

图1 对照组肺组织(HE ×200)Fig 1 The lung tissues of control group(HE ×200)

图2 实验组肺组织(HE ×200)

2.2 Ang-2水平检测结果

实验组SD大鼠Ang-2水平(10.72±1.49)ng/mL明显高于对照组(3.87±0.26)ng/mL,P<0.01；实验组内死亡组SD大鼠Ang-2水平(11.48±1.52)ng/mL亦显著高于存活组(7.69±1.83)ng/mL,P<0.05。

3 讨 论

急性肺损伤(ALI)是一个炎症和通透性增加的综合征，以肺泡-毛细血管膜屏障的破坏为特征，造成富含蛋白的肺泡水肿液的形成和持续的低氧血症[4]。动物模型的建立及应用在了解掌握其发病机制、病理生理改变中占有重要的地位，本实验模型(即盲肠结扎/脓毒症型)是经腹手术在动物盲肠上刺孔并结扎使动物发生组织坏死和肠源性腹腔感染导致全身炎症反应综合征，进一步发展成ALI。发病机制除了内毒素造成以外，还存在肠道其它细菌毒素的致伤作用、手术打击等，故此种模型病情重，肺部病理损害也明显，是较理想的ALI模型之一[5]。

人类Ang-2基因定位于第8号染色体短臂上(8p21),由496个氨基酸组成, 人鼠同源性为85%，Ang-2能够和血管内皮细胞上的Tie-2受体相结合激活相应信号通路发挥作用，导致血管通透性增高，增加血管渗漏，表明Ang/Tie-2系统在炎症反应内皮细胞活化中起重要作用[6]；同时Ang-2是严重创伤后内皮激活和功能障碍的标志物[7]；John S Giuliano等[8]推测外周血Ang-2的水平是一个早期内皮细胞活化及损伤的理想指标；Gallagher等[9]发现，在外科ICU伴ALI/ARDS患者中，死亡组血中Ang-2水平比存活组明显增高，同时还发现，体外用高Ang-2的血浆对内皮细胞单层刺激可破坏其内皮连接，血管内皮钙黏蛋白在内皮连接处分布紊乱，有肌动蛋白应力纤维形成，引起内皮细胞间隙形成；与此相似，Parikh等[10]的研究首次发现Ang-2是脓毒症相关肺损伤时内皮屏障破坏的重要介质，在氧合受损的脓毒症患者，血循环Ang-2水平明显增高，体外应用患者血清可破坏内皮细胞屏障，且内皮屏障的破坏程度和Ang-2含量相关，由此引起肺水肿。本实验观察到实验组SD大鼠血清Ang-2水平明显高于对照组，死亡组水平高于存活组，说明血清Ang-2的升高与ALI严重程度相关，导致肺内皮屏障功能和结构的不同程度的破坏，血管失稳，引起血管渗漏，表现为中性粒细胞及巨噬细胞等炎症细胞浸润，肺泡间隔增宽等，另外血清Ang-2水平的变化对ALI病情评价和预后具有参考价值。由此可见，Ang-2确定是ALI引起肺血管渗漏的关键因素之一，可能利用了脂多糖及肿瘤坏死因子-a等明显上调了肺微循环内皮细胞Ang-2的表达，使血管退化，这与Parikh等发现Ang-2可诱发急性肺水肿的研究结果有类似性。

综上所述，本研究盲肠结扎穿孔术制造SD大鼠脓毒症ALI模型中，肺组织中性粒细胞及巨噬细胞表达增多，血清Ang-2水平也显著升高，表明Ang-2在脓毒症型ALI中具有重要病理作用，血清高Ang-2水平提示预后较差，但具体机制有待进一步探讨。

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