CDK2、CDK4基因与自体移植静脉内膜增殖的关系

亓 明，王新文，罗英伟，秦岭峰，马文锋，张 强，辛世杰，段志泉

(1. 大连医科大学 附属第一医院 血管外科, 辽宁 大连 116011；2.中国医科大学 附属第一医院 血管外科，辽宁 沈阳 110011)

自体静脉旁路移植术是临床上治疗动脉阻塞性疾病的重要手段，常用于冠心病和动脉硬化闭塞症的血管重建。但由于内膜增生(Intimal hyperplasia，IH)及后期的动脉硬化所导致的移植段血管中远期狭窄和闭塞，影响了疗效。现有资料证明，IH的发生为多种因素综合作用的结果，其中血管平滑肌细胞(SMC)向内膜迁移并过度增殖是其病变演变的重要环节[1]。而SMC的增殖，则有赖于细胞周期的进入和进行[2]。

细胞周期是细胞生命活动的基本过程, 细胞在周期时相的变迁中进入增殖、分化、衰老和死亡等生理状态。细胞周期蛋白依赖激酶(Cyclin dependent kinase, CDK) 表达及活性的调控是细胞周期调控的核心,其中CDK2 和CDK4 主要作用于G1期和S期,具有启动DNA复制和诱发有丝分裂的双重作用[3]。体外实验已显示CDK2 、CDK4与细胞增殖之间有密切关系,其表达增加导致DNA 合成增加、进而促进细胞分裂增殖,而其水平下降或其抗体治疗能够抑制或减少细胞增殖[4]。

本实验应用RT-PCR方法和免疫组织化学方法研究细胞周期中G1/S期最具有代表性的CDK2、CDK4在移植血管不同时期的表达情况，探讨其对自体移植静脉SMC增殖和IH的作用,为自体移植静脉再狭窄的防治提供一些依据和思路。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

CDK2、CDK4多克隆抗体，即用型SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；CDK2、CDK4、内参照β-actin引物由上海生物工程公司合成。

1.2 实验对象及分组

雄性Wistar大鼠(中国医科大学实验动物中心提供)50只，2.5～3.0个月龄，体重250～300 g，参照随机对照表随机分为：1，2，3，7，14 d组，每组10只,各实验组大鼠正常颈静脉为对照组。

1.3 动物模型的建立及标本制备

Wistar大鼠用10%水合氯醛(3 mL/100 g)经腹腔麻醉后，在手术显微镜下切取0.5 cm长颈内静脉间置移植于同侧颈总动脉，完成后移植段血管充盈，搏动有力，示血管移植成功。

实验动物分别于术后1、2、3、7及14 d麻醉状态下处死取材。液氮快速冷冻后转-70 ℃保存。

1.4 观测指标

(1)组织学观察：切片行HE染色和Verhoeff-Van Gieson(VVG)染色，用计算机图像分析仪观察血管中段横截面内膜，每60度测量1次该处内膜厚度，共6处，计算平均厚度。

(2)CDK2、CDK4免疫组化观察：切片予微波抗原修复后，SABC法,DAB显色，CDK2、CDK4定位于细胞核和细胞浆，阳性细胞胞核与细胞浆染呈棕黄或黄色，每张切片随机选取10个高倍视野(×400)，计数单位视野阳性细胞占总细胞数的百分率，阳性细胞数<10%为阴性，记为(-)；10%≦阳性细胞数<50%为阳性，记为(+)；阳性细胞数>50%为强阳性，记为(++)。辅以计算机图像分析仪结果。所有结果均由2人盲法单独判定。

(3)应用RT-PCR观察CDK2,CDK4 mRNA表达：组织匀浆，苯酚/异硫氰酸胍法提取总RNA，进行反转录合成cDNA，CDK2 上游引物5′-AAGATCGGAGAGGGCACGTACGGAGTGGTG-3′，下游引物5′-AGGCTCTTGCTAGTCCAAAGTCTGCCAACT-3′，扩增片段长度为430 bp；CDK4上游引物5′-GCTACCACTCGATATGAACCCGTGGCTGAA-3′，下游引物5′-GGTGCTTTGTCCAGGTATGTCCGTAGGTCC-3′，扩增片段长度为320 bp；内参照β-actin上游引物5′-GATTGCCTCAGGACATTTCTG-3′，下游引物5′-GATTGCTCAGGACATTTCTG-3′，扩增片段长度为690 bp。以β-actin为内对照进行PCR扩增(RT-PCR)，扩增产物进行电泳于凝胶自动成像仪1D Kodak上自动成像，应用GelWorks 1D Advanced软件进行结果定量分析。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 移植静脉内膜平均厚度的变化

各组不同时期移植静脉内膜平均厚度情况见表1。移植后7 d，内膜厚度与管壁厚度接近高峰，与对照组及移植后1、2、3 d比较，差异有显著性意义(P<0.05)。

2.2 移植静脉CDK2、CDK4阳性细胞表达率的变化

在正常细胞中仅有少量CDK2、CDK4阳性表达，不超过5%，阳性表达在光镜下表现为棕黄色。移植后1 d阳性细胞表达开始增多。移植后2 d，阳性细胞表达明显增加，至7 d时达到高峰。与移植后1 d相比，差异有显著性意义(P<0.05)。移植14 d后，阳性表达回落，但仍高于正常水平(P<0.05)。

组别1d2d3d7d14d移植静脉组5.01±0.55.50±1.36.90±1.513.61±1.21)14.20±1.81)对照组4.54±0.44.63±0.94.52±0.84.78±0.54.69±0.7

1)与移植后1、2、3 d及对照组比较，P<0.05

各组不同时期移植静脉内膜、中膜CDK2、CDK4阳性细胞表达率见表2。

表2不同时期移植静脉内膜、中膜CDK2、CDK4阳性细胞表达率

Tab 2 Expression of positive cell in grafted vein (±s, %)

1)与移植后1 d及对照组比较，P<0.05

2.3 移植静脉中CDK2、CDK4基因表达的变化

2.3.1 CDK2、CDK4基因电泳结果:CDK2基因RT-PCR扩增产物电泳结果见图1。同一泳道中CDK2基因的表达产量自术后第2天普遍高于内对照β-actin表达产量，静脉移植术后7～14 d为CDK2基因表达的高峰。CDK4基因RT-PCR扩增产物电泳结果见图2。同一泳道中CDK4基因的表达自术后第2天产量普遍高于内对照β-actin表达产量，静脉移植术后7～14 d为CDK4基因表达的高峰。

图1 CDK2基因RT-PCR扩增产物电泳结果

Fig 1 CDK2 gene amplification product of RT-PCR on electrophoresis

Marker为DNA Marker DL2000，由DNA片段2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp以及100 bp构成。扩增片段长度430 bp。Ladder 1-5分别为静脉移植术后1 d、2 d、3 d、7 d、14 d扩增结果，Ladder 6为正常对照静脉，扩增结果为阴性。

图2 CDK4基因RT-PCR扩增产物电泳结果

Fig 2 CDK4 gene amplification product of RT-PCR on electrophoresis

Marker为DNA Marker DL2000，由DNA片段2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp以及100 bp构成。扩增片段长度320 bp。Ladder 1-5分别为静脉移植术后1 d、2 d、3 d、7 d、14 d扩增结果，Ladder 6为正常对照静脉，扩增结果为阴性。

2.3.2 CDK2、CDK4基因表达半定量分析结果：CDK2、CDK4基因表达半定量分析结果见表3、4。CDK2、CDK4的基因表达产量在静脉移植后1 d就开始增加，7～14 d达到高峰。与3 d内表达比较，差异有显著性意义(P<0.05)。

表3 CDK2基因表达半定量分析结果

1)与移植后1、2、3 d比较，P<0.05

表4 CDK4基因表达半定量分析结果Tab 4 Semi-quantitative result analysis of CDK4 gene expression

1) 与移植后1、2、3 d比较，P<0.05

3 讨 论

移植静脉IH是一个多因素、多途径共同参与的复杂病理过程，可能由于取材和吻合的机械性作用、局部血流动力学改变和炎症反应等原因引起的内皮细胞受损及凝血系统活化而诱发。中膜SMC的迁移和增殖是IH形成的核心环节和必要条件[5]。目前认为,任何细胞发生增殖均要经过细胞周期。细胞周期分为以下不同的时相: G0期(静止期) 、G1期(DNA 合成前期) ,S期(DNA 合成期) 、G2期(DNA 合成后期) 和M期 (有丝分裂期) 。多种细胞因子和生长因子影响着细胞周期进展,而细胞周期的每一个时相又受不同的细胞周期调节蛋白的调控。

对平滑肌细胞增殖的调控机制研究发现,细胞增殖周期的完成依赖于CDK的表达和激活,它作为催化亚基与调节亚基周期蛋白 (Cyclins) 构成多种全酶来发挥作用。CDK 是细胞周期调控网络的中心分子,有三条调节途径：Cyclins 与其结合活化CDK ;CKIs 与其结合阻遏CDK活性;细胞因子磷酸化、去磷酸化CDK调控其活性。CDK是有磷酸化作用的激酶，受其调节亚基即Cyclin的活化。两者形成Cyclin-CDK复合物，即具有磷酸化的活性。总之,大量增殖的外膜平滑肌细胞和迁移入内膜下的VSMC 均表现出不同程度、多种细胞周期调节蛋白的表达,这些调节蛋白控制着VSMC 的增殖特性,与动脉硬化的形成有十分密切的关系,有待更深入的研究探讨[6-11]。

本实验所采用的大鼠自体静脉移植模型是较为公认的整体动物模型，与临床实践中以自体静脉为移植物的各种旁路转流术相似。细胞周期中有两个关键转折点：一是G1期进入S期，称为“起始点”，位于G1末期，此时DNA开始合成；二是G2期进入M期，称为“进入点”，位于M期起始部位，此时细胞开始分裂。CDK表达及活性的调控是细胞周期调控的核心,其中CDK2和CDK4主要作用于G1期和S期,具有启动DNA 复制和诱发有丝分裂的双重作用。检测结果表明了CDK2、CDK4基因在移植静脉早期表达就开始增加，且与移植后内膜增生的病理过程一致，在7～14 d达到高峰。说明了CDK2、CDK4基因在移植静脉内膜增生的病理过程中可能起到了重要作用。细胞周期是增殖信号转导的最终共同通路,进入细胞周期和细胞周期的推进是血管增殖性疾病中的关键事件。VSMC 进入增殖状态,不仅伴随着细胞周期的推进,还伴随着化学趋化因子和粘附分子的表达以及细胞外基质的调节。因此,以细胞周期为靶点,牢牢控制VSMC 增殖周期将有望防治再狭窄的发生和发展。CDK2、CDK4基因可能是有希望的靶基因。已经有文献报道在动脉球囊损伤模型中应用反义CDK2基因可以抑制内膜增生。在G1期/S期CDK2、CDK4基因共同表达增加，也说明了细胞周期的推进和内膜增生是多种基因相互作用的结果，多基因多环节的联合基因治疗可能是今后的研究方向。

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