应用搅拌棒吸附-热脱附-气相色谱/质谱法分析烟草中挥发性与半挥发性物质

李 理，杨新周，刘汗青,*

（1.昆明冶金高等专科学校环境工程学院，昆明 650033；2.云南烟草科学研究院，昆明 650106）

烟草中含有丰富的挥发性、半挥发性成分，这些物质与烟草质量密切相关，对烟气的感官性质有重要影响，因此被列为评价烟草质量的重要参数[1]。以往的分析方法中，无论是水蒸气蒸馏，还是同时蒸馏萃取都需要大量有机溶剂进行前处理[2]，且操作时间较长、繁琐，不能满足快速准确分析的要求。

固态萃取搅拌棒（SBSE）是近几年新发展起来的技术之一。1999年加拿大学者 Arthur和Janusz Pawliszyn等学者在研究固相微萃取（SPME）技术时发现，虽然样品中被测定物质的浓度很高，但是SPME测定的回收率仍然很低，测定的灵敏度仍然不够高[3]。他们通过研究发现：将聚二甲基硅氧烷（PDMS）涂敷在萃取棒上（膜厚0.5-1.0mm），萃取棒固相萃取体积是SPME的50倍以上[4]，具有比SPME更小的相比（水相体积/PDMS相体积），获得了很高的测定灵敏度和回收率。之后，Gerstel GmbH公司实现了商品化的磁力搅动吸附萃取棒。从此，SBSE应用于各种水体样品中痕量有机物的分离和浓缩。它不同于传统的液液萃取、固液萃取等。SBSE不需要有机溶剂，是一种环境友好型、简便的萃取技术，特别是在许多易乳化、不均匀的样品中表现出突出的优势。

SBSE的解吸有热解吸与溶剂解吸2种方式。应根据分析对象的物理性质来选择合理的解吸方法。如果萃取的是热不稳定、不挥发物质，则采用溶剂解析，再用HPLC分析[5]。

目前，该方法在国外已被广泛应用到食品[6-7]、环境[8-9]等领域，成为了一种简便、灵敏的分析技术，而在国内 SBSE的应用还不够广泛。本研究采用SBSE萃取烟草挥发性与半挥发性成分，萃取后的搅拌棒放入热解吸－冷进样系统（TD-CIS）实现解吸并导入气相色谱/质谱仪进行检测。同时还对影响SBSE和Thermal desorption system (TDS）的实验条件进行了优化，考察了实验方法的重现性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂、材料

Gerstel Twister搅拌棒（长20 mm，厚0.5 mm），Gerstel TDU-3热解吸装置，Gerstel玻璃热脱附管（4 mm i.d.×178 mm），Gerstel CIS冷进样系统（德国Gerstel公司）；Clarus 500 气相色谱-质谱联用仪（美国Pekin-Elmer 公司）；HP-5MS毛细管柱（0.25 mm i.d.×30 mm×0.25 µm，美国）；恒温加热磁力搅拌器（杭州仪表厂JB-007）；AEU-210电子天平（感量 0.0001g，日本岛津公司）；B8510E 超声波振荡器（上海必能信超声有限公司）。

自制蒸馏水；乙醇（分析纯，上海化学试剂厂）；Na2SO4（分析纯，天津试剂一厂）；云南烤烟B3F。

1.2 仪器条件

SBSE萃取条件：萃取温度为室温（30 ℃），萃取时间1 h，搅拌速度为1 000 r/min。

热解吸条件：从20 ℃以50 ℃/min的速率升至250 ℃，保持 4 min，不分流进样，传输线温度350 ℃。

冷进样系统条件：采用溶剂排空模式进样，分流比30:1，冷聚焦温度为-30 ℃，以12 ℃/s的速率升至280 ℃，保持5 min。

气相色谱-质谱条件：色谱柱温 40 ℃保持 2 min，以3 ℃/min升至150 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至250 ℃，保持10 min；载气为氦气，流速1.2 mL/min；GC/MS传输线温度为280 ℃；电子轰击离子源（EI），离子源温度为 230 ℃，电子能量为70 eV；采用全扫描模式采集数据，质量扫描范围为30～400 m/z，用NIST02和WILEY7n标准图谱库进行数据检索。

1.3 操作步骤

搅拌棒在使用前夜放入TDS热脱附管中老化。将烟叶样品粉碎后过100目筛，称取10 g样品于100 mL锥形瓶中，加入30 mL乙醇，超声萃取30 min后，取上层萃取液2 mL加入到25 mL顶空瓶中，加入18 mL蒸馏水后放入搅拌棒，并密封好玻璃瓶。放入老化好的搅拌棒，在室温下，以 1000 r/min的转速磁力搅拌60 min。萃取完成后使用干净的镊子将搅拌棒从样品瓶中取出，用蒸馏水冲洗搅拌棒上的附加物质（如糖、蛋白质及其它脏物）后，放在干燥的棉布上擦干净，再将干净的搅拌棒放入玻璃脱附管中部，以便使其均匀加热，进而达到样品完全解吸。

2 结果与讨论

2.1 萃取条件的优化

2.1.1 搅拌液中乙醇含量 采用超声法用乙醇对烟草样品萃取，然后用蒸馏水稀释乙醇萃取液再进行搅拌棒吸附萃取。实验中考察了搅拌液中乙醇的体积分数（5%、8%、10%、15%、20%）对搅拌棒萃取量的影响，结果见图1。可以看出，当搅拌液中乙醇的体积分数小于10%时，随着乙醇含量的升高，搅拌棒萃取效率（以峰面积计）增加，当体积分数达到10%时，萃取量最大，之后乙醇含量再升高反而降低萃取效率。因此，本实验确定搅拌液中乙醇体积分数为10%。

图1 乙醇体积分数对萃取效率的影响Fig.1 Effect of ethanol content on extraction efficiency

2.1.2 萃取时间 萃取时间是影响样品中各组分从水溶液转移进入搅拌棒的一个重要因素，达到平衡后再无限地延长萃取时间也没有实际意义。在室温条件下，分别称量相同的样品，将搅拌速度控制在1000 r/min，萃取时间选取25、35、45、60、70、80 min，获得不同时间条件下色谱峰面积总和，来确定最佳萃取时间，结果见图 2。可以看出，随着萃取时间的延长，在25～45 min内色谱峰峰面积总和迅速增加，60 min后，峰面积增加减缓，最后趋于平稳。考虑到实验周期和工作效率，将萃取时间定为60 min。

图2 萃取时间对萃取效率的影响Fig.2 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.1.3 搅拌液离子强度 SPE是SPME和SBSE的理论基础，因此，离子强度对SBSE的萃取也会产生影响。实验中分别向样品中加入不同质量浓度的Na2SO4水溶液（0%、4%、7%、10%），调节样品离子强度，使待测物溶解度降低。通过比较发现，随着盐浓度增加，月桂酸、葵酸、肉豆蔻酸、棕榈酸等的峰面积增加，但二氢猕猴桃内酯、邻苯二甲酸酯、棕榈酸乙酯、吲哚-2-甲酸乙酯等的峰面积变小。加入Na2SO4水溶液与未加Na2SO4相比较，并未检测到更多的物质。可见 Na2SO4的加入并不能明显提高该样品的萃取效率，同时随 Na2SO4浓度的增加，多数物质萃取效率反而降低。因此，实验中选择不加入Na2SO4。

综合上述优化实验的结果，确定SBSE萃取条件为：搅拌液乙醇体积分数为10%，不加Na2SO4，以1000 r/min的转速搅拌吸附60 min。

2.2 TDS技术条件的优化

萃取棒上所吸附的样品能否实现完全解吸，关系到实验结果的准确性。在相同的SBSE条件下，热解吸温度（A）、解吸时间（B）和进样口冷聚焦温度（C）3个实验条件是影响被分析物从搅拌棒上转移至气相色谱的主要参数。因此，固定SBSE条件，应用正交试验法，在3个水平上对3个影响因素进行试验，制定出正交试验表（表1）。

表1 正交试验因素－水平表Table1 Factor and level of orthogonal test

实验结果表明，各因素对实验结果影响的大小依次为：进样口冷聚焦温度＞热解吸温度＞解吸时间，即冷肼温度对实验结果影响最大。较好的实验水平组合为A1B2C3，即SBSE在250 ℃下脱附4 min，以-30 ℃的温度冷肼捕集，得到的被测物质的总峰面积最大。

2.3 样品分析

按照上述实验方法，在优化的实验条件下对该烟草样品进行测定，得到样品总离子流色谱图（图3），共分离得到 63个组分，经标准谱库检索色谱峰分析，结果见表2。表2中采用峰面积归一化法计算各组分百分含量（各组分峰面积/总峰面积）。定性分析是将未知物的图谱与NIST02和WILEY7n标准图谱库相比较，选取匹配度大于85%（最大值为100%）的作为鉴定结果，共鉴定出32个组分，占总峰面积的97%。从表中可以看出，样品含有大量的酯类和烯类、酸类化合物，其中酯类占28%、烯类占 19%、酸类占 16%，同时还含有少量醇类（9%）和醛类（6%）等化合物，这些化合物都是特征香气的物质，能反映该烟草的品质特点。与彭夫敏[10]，胡群[11]报道的烟草挥发性成分鉴定结果相对照，主要物质组成基本一致。

图3 样品总离子流色谱图Fig.3 Total ion current chromatogram of a real sample

表2 样品主要化学成分及其相对含量Table 2 The major components of real sample and their relative contents

2.4 实验方法的重现性

分别称量同一样品相同质量6份，同一天内在上述确定的优化实验条件下进行测定。实验结果表明，32个组分的峰面积的相对标准偏差（RSD）最大的是维甲酸甲酯，为12.3%；最小的是3-羟基-4-甲基苯甲醛，为3%。其中有29个组分的RSD小于10%，平均值为7.5%，说明该实验方法具有良好的重现性。

3 结 论

本研究采用搅拌棒萃取和热脱附作为前处理技术，结合气相色谱/质谱测定了烟草挥发性与半挥发性成分，从样品中鉴定出 32个不同化学成分，这些物质能反应该样品的香气特征。并对影响搅拌棒与热解吸的实验条件进行了考察与优化，得到的较优实验条件是：搅拌棒萃取条件为室温（30 ℃）下，不加入Na2SO4，以1000 r/min的转速搅拌吸附60 min；热解吸实验条件为从20 ℃以50 ℃/min的速率升至250 ℃，保持4 min，被测组分通过流速为50 mL/min的氦气转移到冷进样系统中进行冷肼聚焦；冷进样系统实验条件为采用溶剂排空模式进样，分流比30:1，冷聚焦温度为-30 ℃，以12 ℃/s的速率升至280 ℃，将萃取的目标分析物转移至气相色谱/质谱中进行分离和鉴定。同一样品6次测定的不同组分峰面积的RSD平均值小于10%，说明建立的实验方法重复性较好，与传统的分析方法相比，分析时间缩短为原来的三分之一，所需样品量少、灵敏度高，是一种环保、简便的分析技术。

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