艾洛替尼耐药肝癌HepG2细胞系的建立及其耐药机制

任志广，赵青，魏寅祥，贾砚寒，李新颖，黎燕，彭晖，马远方

(1.河南大学医学院细胞与分子免疫学实验室，河南开封475004;2.军事医学科学院基础医学研究所分子免疫学研究室，北京100850;3.南开大学医学院，天津300071)

艾洛替尼耐药肝癌HepG2细胞系的建立及其耐药机制

任志广1，2，赵青2，3，魏寅祥1，2，贾砚寒2，李新颖2，黎燕2，彭晖2，马远方1

(1.河南大学医学院细胞与分子免疫学实验室，河南开封475004;2.军事医学科学院基础医学研究所分子免疫学研究室，北京100850;3.南开大学医学院，天津300071)

目的体外建立艾洛替尼(erlotinib)耐药的人肝癌细胞系HepG2/erlotinib，鉴定其生物学特性，并对其耐药机制进行初步探讨。方法逐步递增艾洛替尼并最终给予艾洛替尼50 μmol·L－1连续冲击HepG2细胞12个月，建立HepG2/erlotinib。磺酰罗丹明B法检测HepG2/erlotinib耐药倍数和耐药谱;测定细胞生长曲线并计算细胞增殖时间;流式细胞术检测细胞周期;RT-PCR和Western印迹法检测HepG2/erlotinib细胞乳腺癌耐药蛋白(BCRP)基因和蛋白的表达;流式细胞术检测细胞表面BCRP蛋白表达。结果经过12个月艾洛替尼诱导的HepG2耐药细胞，艾洛替尼的IC50值为(72.3±6.1)μmol·L－1，艾洛替尼对正常HepG2细胞的IC50值为(10.6±0.3)μmol·L－1，耐药倍数为6.8±0.7，表明HepG2/erlotinib为艾洛替尼耐药细胞系。HepG2/erlotinib对顺铂、多柔比星、米托蒽醌和拓扑替康的IC50均大于正常HepG2细胞的IC50，表明产生交叉耐药性。HepG2细胞和HepG2/erlotinib细胞的群体倍增时间分别为(20.7±3.3)h和(26.7±1.2)h，耐药细胞倍增时间延长。与HepG2细胞相比，HepG2/erlotinib的S期细胞比例明显增高(P＜0.05)，G0/G1期细胞比例明显降低(P＜0.01);HepG2/erlotinib细胞中BCRP基因和BCRP蛋白表达显著升高(P＜0.05)。结论建立的HepG2/erlotinib具有耐药细胞的特征和生物学特性，其耐药机制与BCRP蛋白表达增加有关。

艾洛替尼;肝癌;细胞系;耐药

大量研究表明，人类多种常见癌症中均有表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)高表达，其中包括肝癌(EGFR表达率占58.18%［1］)。近年来，分子靶向药物开始试用于晚期肝癌治疗，个别药物取得了突破性进展。艾洛替尼(erlotinib)作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI)对许多表达EGFR的患者癌细胞系都具有抑制活性，如卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、子宫颈癌及头颈癌等［2］，其作为治疗NSCLC和胰腺癌的药物已被美国FDA批准上市［3］，但是在临床治疗NSCLC中出现了耐药现象［4］。现在艾洛替尼用于肝癌的治疗已经处于Ⅲ期临床研究，将来有可能作为EGFR-TKI治疗肝癌。多个Ⅱ期临床研究显示出喜人的结果［5－6］，一项艾洛替尼治疗晚期肝癌的Ⅱ期临床研究显示［6］，38例不宜手术的晚期肝癌患者在接受艾洛替尼治疗后，12例(32%)在6个月时没有出现肿瘤进展，其中3例(8%)达到部分缓解并分别维持了2，10和11个月，19例(50%)病情稳定，中位疾病进展时间为3.2个月，中位生存期为13个月。其单药或联合其他药物治疗的临床研究正在进行中，以EGFR为靶点的治疗方法被认为是最有希望的肝癌靶向治疗途径之一［7］。本研究选取高表达EGFR的肝癌HepG2细胞来诱导艾洛替尼的耐药，探讨EGFR在未来肝癌靶向治疗的可行性及疗效，进而为其发病机制研究和耐药防治提供新的思路和理论依据。本研究采用逐步递增给予艾洛替尼冲击HepG2细胞，建立艾洛替尼耐药的肝癌HepG2细胞系，并观察其生物学特性和耐药机制，为研究肿瘤细胞对艾洛替尼耐药的分子机制及设计和筛选有效的抗耐药肿瘤药物提供了条件。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂和仪器

艾洛替尼购自百灵威公司，纯度＞98%，以二甲基亚砜(DMSO)溶解成10 mmol·L－1储备液，临用前用培养基稀释;顺铂和盐酸米托蒽醌注射液，江苏豪森药业股份有限公司生产;注射用盐酸多柔比星，辉瑞制药有限公司产品;紫杉醇注射液，浙江海正药业股份有限公司产品;注射用盐酸拓扑替康，黄石飞云制药有限公司产品;药物以DMSO溶解成5 mmol·L－1储备液，临用前用培养基稀释为相应浓度;高糖DMEM培养基购自Hyclone公司，胎牛血清购自元亨金马公司;磺酰罗丹明B(SRB)购自Sigma公司;一抗小鼠抗人ABCG2(BCRP，ab3380)单克隆抗体购自Abcam公司，一抗小鼠抗人GAPDH(CB100127)单克隆抗体购自California Bioscience公司，二抗辣根酶标记山羊抗小鼠IgG抗体(HRP-GAM，2B-2305)购自中山金桥公司;流式直标PE抗体5D3〔乳腺癌耐药蛋白(BCRP)，CD338〕购自eBiosciences公司;PVDF膜购自Millipore公司;碘化丙啶(propidium iodide，PI)购自Sigma公司;Trizol购自Invitrogen公司;逆转录试剂盒购自全式金生物技术有限公司;Tap酶及其他分子生物学试剂购自天根生化科技有限公司;其余试剂为国产分析纯试剂。Forma 3111型CO2培养箱(美国);Olympus CK40型倒置显微镜(日本);BD FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司);PCR扩增仪Eppendorf AG22331(德国)。

1.2 细胞系和细胞培养

人肝癌细胞系HepG2为本室传代保存，细胞在含有10%灭活胎牛血清，青霉素100 kU·L－1和链霉素100 kU·L－1的DMEM完全培养基中，放入37℃，5%CO2孵箱中培养。0.02%EDTA-2Na和0.25%胰蛋白酶按1∶1混合后消化传代。细胞按常规方法培养，并取对数生长期的细胞用于实验。

1.3 HepG2/erlotinib耐药细胞系的诱导

采用程国钧等［8－9］介绍的逐步递增联合大剂量方法在体外进行诱导，具体方法为:取对数生长期的HepG2细胞加入到含艾洛替尼的DMEM培养液中，从低浓度0.5 μmol·L－1开始，处理24 h后撤去含药培养基，加入新的培养基继续培养，细胞恢复正常生长后加入高浓度的艾洛替尼，反复换液传代，逐步提高浓度，分别为1，5，10，20，50 μmol·L－1，间歇换液诱导，艾洛替尼最终处理浓度为50 μmol·L－1。经过12个月的诱导，成功建立艾洛替尼耐药的肝癌细胞系HepG2/erlotinib。

1.4 SRB法检测药物体外的耐药倍数和交叉耐药谱

取对数生长期的HepG2和HepG2/erlotinib细胞制成单细胞悬液接种到96孔板中，每孔细胞数为3×104个，37℃，5%CO2培养箱孵育24 h后加入艾洛替尼0，0.025，0.1，0.4，1.56，6.25，12.5，25和100 μmol·L－1检测耐药倍数，顺铂、多柔比星、紫杉醇、米托蒽醌和拓扑替康0，0.003，0.012，0.05，0.20，0.78，3.125，12.5和50 μmol·L－1检测交叉耐药谱［10］，溶液总体积为200 μl，均设3个复孔。继续培养72 h，以SRB［11］法检测，具体步骤如下:用真空泵将96孔板中的培养基吸出，每孔加入70 μl SRB染液，室温反应30 min，150 μl 1%醋酸溶液洗板3次，晾干，最后每孔200 μl加入Tris溶液10 mmol·L－1溶解染液，用酶标仪检测570 nm的吸光度(A)值。以Prism 3.0软件对数据进行处理并计算药物的半数抑制浓度IC50，即细胞存活率减少50%时的药物剂量。并计算HepG2/erlotinib细胞对相应药物的耐药倍数，耐药倍数(resistant factor，RF)=药物在HepG2/erlotinib细胞中的IC50/药物在HepG2细胞中IC50值［12］。

1.5 HepG2/erlotinib细胞群体倍增时间测定

取对数生长期的HepG2和HepG2/erlotinib细胞，按1×104个每孔分别接种于24孔板中，设置3个复孔，放置37℃，5%CO2培养箱孵育，分别在24，48，72，96，120和144 h进行细胞计数，并计算平均值。以细胞数为纵坐标，培养时间为横坐标绘制细胞生长曲线。按照Patterson法［13］计算细胞群体倍增时间，细胞群体倍增时间=t×lg2/(lgNtlgN0)，其中t为Nt－N0的时间，N0为初始细胞数，Nt为终末细胞数。

1.6 流式细胞术检测HepG2/erlotinib细胞的细胞周期

收集HepG2和HepG2/erlotinib细胞，按照每管5×105个细胞进行实验，PBS洗2次，70%冰乙醇－20℃固定36 h，PBS洗2次，加入100 μl RNA酶1 g·L－1，37℃避光孵育30 min，再加入100 μl PI染液避光孵育30 min，置流式细胞仪检测，Cell Quest软件分析细胞周期比例。

1.7 RT-PCR检测耐药基因BCRP的表达

用于特异性扩增BCRP上游引物为CCCGCGACAGCTTCCAATGA，下游引物为GGCGTTGAGACCAGGTTTCA，扩增长度171 bp。用于特异性扩增GAPDH上游引物为CCGTCTAGAAAAACCTGCC，下游引物:GCCAAATTCGTTGTCATACC扩增长度320 bp。由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成引物。收集对数生长期的HepG2和HepG2/erlotinib各5×106个细胞，用Trizol试剂提取细胞中的总RNA。取2 μl RNA，再加入Oligo(dT)，TX Mix，2×TX Mix，无RNA酶H2O，反应总体积20 μl，混匀，42℃反应30 min，85℃反应5 min，反应产物－20℃保存。取2 μl逆转录产物，再加入相应引物、2×Tap Mix、适量去离子水，混匀，PCR扩增仪扩增目的基因，反应结束，进行EB琼脂糖凝胶电泳，紫外灯观察结果并照相，对基因条带进行灰度分析，以GAPDH为内参，计算BCRP基因表达。

1.8 Western印迹法检测BCRP蛋白的表达

收集对数生长期HepG2和HepG2/erlotinib各5×106个细胞，PBS洗2次，在冰上加入WB裂解液，制备蛋白样品。取30 μg样品上样于12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束将蛋白条带转印至PVDF膜上，一抗1∶1000，4℃孵育过夜，洗涤后加入山羊抗小鼠的IgG二抗1∶2000室温孵育1 h，以ECL显色，暗室曝光，对蛋白条带进行灰度分析，以GAPDH为内参，计算BCRP蛋白表达。

1.9 流式细胞术检测BCRP表达

收集对数生长期细胞HepG2和HepG2/erlotinib各5×105个细胞，PBS洗2次，每管加入10 μl PE直标BCRP抗体，4℃避光孵育30 min，PBS洗2次，最后以300 μl PBS悬浮细胞，流式细胞仪检测分析。阳性率以细胞膜表面BCRP蛋白与抗体结合的强度Gate值表示［14］，实验重复3次取平均值。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 HepG2/erlotinib耐药系耐药特性鉴定

HepG2细胞经12个月的连续诱导、培养，传代30次以上后，可以稳定生长在含有艾洛替尼50 μmol·L－1的DMEM培养基中。新建立的细胞系，HepG2/erlotinib，细胞毒检测结果显示，艾洛替尼对于HepG2/erlotinib的IC50值为(72.3±6.1)μmol·L－1，而对于HepG2的IC50值为(10.6±0.3)μmol·L－1，其耐药倍数为(6.84±0.7)倍。HepG2/erlotinib细胞系停止艾洛替尼刺激1个月，细胞的耐药倍数仍能保持6倍左右。表明HepG2/erlotinib为艾洛替尼稳定耐药系。

2.2 HepG2/erlotinib细胞交叉耐药谱

表1结果显示，HepG2/erlotinib对多柔比星、顺铂、米托蒽醌和拓扑替康的IC50明显高于相应的HepG2细胞的IC50(P＜0.01)，耐药倍数以米托蒽醌最高，达10.87±0.92，最低的紫杉醇，为0.49±0.01，说明HepG2/erlotinib细胞为多药耐药细胞;多柔比星、米托蒽醌和拓扑替康均为耐药相关蛋白BCRP的底物［15］，提示HepG2/erlotinib耐药性可能与BCRP相关。

Tab.1 IC50of HepG2 cells and HepG2/erlotinib cells to different anticancer agents

2.3 HepG2细胞和HepG2/erlotinib细胞群体倍增时间

图1为HepG2细胞和HepG2/erlotinib细胞的生长曲线。从图中可以看出，HepG2/erlotinib细胞的群体倍增时间明显高于HepG2细胞，分别为(20.7±3.3)h和(26.7±1.2)h，差异有统计学意义(P＜0.05)。

Fig.1 Proliferative rate of HepG2 and HepG2/erlotinib cells.±s，n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with HepG2 cells.

2.4 HepG2和HepG2/erlotinib的细胞周期

如表2所示，与HepG2细胞相比，HepG2/erlotinib细胞的G0/G1期比例减少(P＜0.01)，S期比例增加(P＜0.05)，G2/M期比例稍有增高，但差异没有统计学意义。

Tab.2 Cell cycle of HepG2 and HepG2/erlotinib cells

2.5 耐药基因BCRP在HepG2/erlotinib中的表达

图2显示，HepG2细胞中未见相应BCRP条带显示，说明HepG2细胞中无BCRP的表达;而在HepG2/erlotinib细胞中耐药基因BCRP表达有明显水平。定量结果显示，HepG2灰度值(0.14±0.12)，HepG2/erlotinib灰度值(0.44±0.16)，两者之间存在显著性差异(P＜0.05)(图B)，表明HepG2/erlotinib耐药性的出现与BCRP的高表达有关。

Fig.2 Breast cancer resistance protein(BCRP)mRNA expression in HepG2 and HepG2/erlotinib cells.

2.6 BCRP蛋白在HepG2/erlotinib中的表达

图3显示，HepG2细胞中未见相应BCRP条带，说明HepG2细胞中无BCRP蛋白的表达;而在HepG2/erlotinib细胞中耐药蛋白BCRP表达有明显水平。定量结果显示，HepG2灰度值(0.83±0.01)，HepG2/erlotinib灰度值(0.94±0.04)，两者之间存在显著差异(P＜0.05)，表明HepG2/erlotinib耐药性的出现与BCRP蛋白的高表达有关。

Fig.3 BCRP protein expression in HepG2 cells and HepG2/erlotinib cells by Western blotting.

图4中的流式细胞术检测结果显示，HepG2/erlotinib细胞膜表面有BCRP蛋白表达，HepG2细胞与BCRP抗体结合阳性率仅为(1.49±0.44)%，HepG2/erlotinib细胞与BCRP抗体结合阳性率为(11.51±1.39)%(P＜0.01)，进一步表明HepG2/erlotinib耐药性的出现与BCRP蛋白的高表达有关。

Fig.4 BCRP protein expression on HepG2 and HepG2/erlotinib cell surface by flow cytometry.1:HepG2 cells;2:HepG2/erlotinib cells.

3 讨论

目前，我国是世界上肝癌发病率最高的国家，发病数占全世界的55%，死亡数占45%［16］，且在肝癌中有较高的EGFR表达率［7］，多药耐药是影响化疗后的疗效和临床预后的主要原因［17］，因此寻找新的治疗药物和解决药物产生的耐药性为治疗肝癌的策略和手段。肿瘤的耐药机制复杂，体外建立肿瘤细胞耐药株模型为研究耐药机制提供先决条件［9］。艾洛替尼作为肝癌的分子靶向治疗，已经进入Ⅲ期临床研究，极有可能成为第一个EGFR-TKI用于肝癌治疗。艾洛替尼在临床治疗NSCLC中已出现了耐药现象，其主要原因是EGFR T790M突变导致对EGFR-TKI治疗的耐药性的产生［18］，而HepG2/erlotinib耐药细胞中进行EGFR突变区检测并未发现T790M突变，提示肝癌对艾洛替尼耐药机制复杂与NSCLC有所不同。

本研究采用逐步递增联合大剂量冲击方法，经过12个月的诱导培养，成功建立了艾洛替尼耐药的肝癌细胞系HepG2/erlotinib，为深入研究肝癌艾洛替尼的耐药机制和筛选耐药逆转剂提供了理想的模型。对其细胞特性进行了初步鉴定，耐药倍数为6.84±0.7，与HepG2细胞相比，HepG2/erlotinib细胞的G0/G1期比例减少及S期比例增加，可能与耐药细胞生长速度变慢有关，细胞的群体倍增时间变长，表明HepG2/erlotinib细胞对药物的敏感性下降［19］。耐药谱检测发现对化疗药物顺铂、多柔比星、米托蒽醌和拓扑替康有一定的交叉耐药性，对紫杉醇保持敏感，而多柔比星、米托蒽醌和拓扑替康是耐药相关蛋白BCRP的底物［15］，表明HepG2/erlotinib的耐药性的出现可能与BCRP相关。RT-PCR，Western印迹法和流式细胞术研究结果证实了耐药细胞中存在BCRP基因和蛋白的表达上调，说明其耐药性的产生与BCRP相关。以往的肝癌耐药性研究中，Ding等［20］报道肝癌耐药产生与P糖蛋白有相关，而杨俊霞等［21］在诱导建立顺铂耐药的肝癌细胞系时发现其耐药性的产生与细胞内谷胱苷肽S转移酶蛋白的高表达相关，可能与所用的不同化疗药治疗相关，也说明了肝癌细胞产生耐药性的复杂性。而本实验室建立的HepG2/erlotinib细胞，与多个化疗药有交叉耐药，其耐药性的产生是否与P糖蛋白和谷胱甘肽S转移酶蛋白相关还有待进一步研究。HepG2/erlotinib细胞系对DNA损伤类药物顺铂也存在交叉耐药，表明其耐药机制的复杂性，为此我们将用基因组学和蛋白组学的研究方法进一步阐明其耐药的产生机制。

总之，HepG2/erlotinib细胞对艾洛替尼产生耐药的原因很复杂，本研究初步鉴定了HepG2/erlotinib细胞中BCRP蛋白的高表达与其耐药性有一定的关系。此外，HepG2/erlotinib耐药细胞系的建立，也为进一步研究分子靶向在肝癌治疗中的应用、可能的耐药机制和筛选耐药逆转剂提供了物质基础。

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Establishment of erlotinib-resistant HepG2 cell line and its resistant mechanisms

REN Zhi-guang1，2，ZHAO Qing2，3，WEI Yin-xiang1，2，JIA Yan-han2，LI Xin-ying2，LI Yan2，PENG Hui2，MA Yuan-fang1
(1.Laboratory of Cellular and Molecular Immunology，School of Medicine，Henan University，Kaifeng475004，China;2.Department of Molecular Immunology，Institute of Basic Medical Sciences，Academy of Military Medical Sciences，Beijing100850，China;3.School of Medicine，
Nankai University，Tianjin300071，China)

OBJECTIVETo establish a human hepatocellular carcinoma cell line with resistance to erlotinib，and to investigate its possible resistance mechanism.METHODSThe cell line HepG2 was cultured by gradually increasing dose of erlotinib and final dose 50 μmol·L－1in vitro for 12 months to generate its resistance cell line HepG2/erlotinib.The resistant index of ertotinib was determined by sulforhodamine B(SRB);cell growth curve，doubling time and cell cycle phase distribution were measured;breast cancer resistance protein(BCRP)mRNA and its protein level were examined by RT-PCR，Western blotting and flow cytometry.RESULTSAfter induced for 12 months，a resistant cell line HepG2/erlotinib was established.The IC50value of HepG2/erlotinib to erlotinib was(72.3±6.1)μmol·L－1while that of HepG2 to erlotinib was(10.6±0.3)μmol·L－1，with the resistant index of 6.84±0.7.The IC50values of HepG2/erlotinib to cisplatin，doxorubicin，mitoxantrone and topotecan were greater than that of HepG2 cells，indicated that it had cross resistance to these drugs.The doubling time of HepG2 and HepG2/erlotinib was(20.7±3.3)h and(26.7±1.2)h，respectively.In the HepG2/erlotinib resistant cell line，the cell numbers of S phase increased(P＜0.05)while that of G0/G1phase decreased(P＜0.01).HepG2/erlotinib cells expressed higher levels of BCRP mRNA and BCRP protein compared with parental cells(P＜0.05).CONCLUSIONAn erlotinib-resistant human hepatocellular carcinoma cell line HepG2/erlotinib is established.It shows a typical resistant phenotype and biological characteristics.The high BCRP expression may contribute to its resistance to erlotinib.

erlotinib;hepatocellular carcinoma;cell line;drug resistance

The project supported by National Natural Science Foundation of China(30873083);and National Natural Science Foundation of China(81173082)

PENG Hui，E-mail:p_h2002@hotmail.com，Tel:(010)66931326;MA Yuan-fang，E-mail:mayf@henu.edu.cn，Tel:(0378)3885036

R979.1

A

1000-3002(2012)06-0823-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.06.008

国家自然科学基金(30873083);国家自然科学基金(81173082)

任志广(1986－)，男，硕士研究生，E-mail:renzhiguang66@126.com，主要从事肿瘤药理学研究。

彭晖，E-mail:p_h2002@hotmail.com，Tel:(010)66931326;马远方，Tel:(0378)3885036，E-mail:mayf@henu.edu.cn

2012-01-05接受日期:2012-03-13)

(本文编辑:乔虹)