preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达

牛明福，吉萍，武汉良，邵勇，高丽华，胡显文

(1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003;2.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071)

preS1-preS2-HBsAg真核表达载体的构建及在293细胞中的表达

牛明福1*，吉萍1，2*，武汉良1，邵勇2，高丽华2，胡显文2

(1.河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳471003;2.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071)

目的研究含有前S1抗原、前S2抗原的乙肝病毒外膜蛋白(前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白)的跨膜特性。方法依据乙肝病毒大外膜蛋白的计算机模拟图将其分为分别命名为HBsAg1(1-174)，HBsAg2(1-245)，HBsAg3(1-294)，HBsAg4(1-341)，HBsAg5(1-373)，HBsAg6(1-400)，最终累加成一条连续的长链状态，贯穿在细胞内外形成四次跨膜区，并以此6个片段为模板设计6对引物。从含有乙肝病毒外膜蛋白基因的质粒pcDNA3.1-preS1-preS2-HBsAg中扩增出前S1，S2基因，采用重叠延伸PCR方法连接人尿激酶原信号肽+6×组氨酸(His)+前S1蛋白、前S2蛋白+HBsAg(1～6)+血细胞凝集素(HA);PCR产物经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后插入经同样处理的真核表达载体pIRES2-EGFP，构建含有Pro-UK，6×His，preS1，preS2，HBsAg跨膜序列及HA的表达载体pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA，该表达载体应能够共表达乙肝病毒外膜蛋白和绿色荧光蛋白。采用阳离子脂质体法将构建好的表达载体转染293细胞，经G418加压筛选阳性克隆，并进一步通过荧光观察、蛋白质免疫印迹、免疫双标等方法检测目的蛋白在293细胞的表达。结果PCR结果显示，电泳片段大小符合HBsAg1～HBsAg6片段的600，810，957，1098，1194和1275 bp理论值。酶切鉴定正确的重组质粒测序结果与预期序列完全一致。转染和单克隆筛选后得到转染成功的HBsAg1～HBsAg6的293细胞，呈亮绿色，细胞形态良好，荧光表达强度高;Western印迹结果显示，在相对分子质量31 000，34 000，44 000，47000，54 000和60 000处有明显的阶梯状蛋白信号，条带清晰并与理论值相一致。结论成功构建了含有前S1、前S2蛋白的乙肝外膜蛋白基因的真核表达载体，并获得了能共表达乙肝外膜蛋白跨膜序列和绿色荧光蛋白的293细胞系。

真核表达载体，pIRES2-EGFP;乙肝外膜蛋白;293细胞

我国是乙型肝炎感染的高发区，母婴传播和婴幼儿感染形成耐受性是我国乙型肝炎病毒(HBV)感染的流行和发病的特点之一。HBV主要以一种尚未明确的机制感染肝细胞。接种乙肝疫苗是控制乙型肝炎传播最为直接和最为有效的措施［1-2］。在HBV感染期间，肝细胞大量分泌20 nm的外膜主蛋白颗粒，由细胞系或酵母产生的同样颗粒就是有效预防病毒感染的疫苗［3］。乙肝疫苗经历了乙肝病毒外膜主蛋白(s蛋白，HBsAg)重组疫苗;乙肝病毒外膜主蛋白、中蛋白(前S2蛋白+S蛋白)及大蛋白(前S1蛋白+前S2蛋白+S蛋白)重组疫苗和乙肝DNA疫苗等几个阶段。这些疫苗有效地降低了HBV母婴传播的发生率，但在人体保护率、抗体应答水平及免疫持久性等方面还存在一定的问题。因此，寻找免疫原性更强的HBV疫苗就成为了主要研究方向。

HBV的外膜由开放读码框S基因(S-ORF，核苷酸nt2854-0-832)编码合成，包括3种外膜成分:大蛋白(L)，中蛋白(M)和主蛋白(S)，它们由1个开放读码框编码，分别使用3个起始密码子和1个共同的终止密码子。外膜蛋白主要是主蛋白HB-sAg，由226个氨基酸组成，是携带全部抗原反应性的结构蛋白。M是在S的氨基端扩加55个氨基酸(前S2蛋白)，前S2蛋白在外膜三种蛋白成分中的免疫原性最强;L是在M前再扩加108～119个氨基酸(前S1蛋白)。病毒附着于肝细胞，最重要的介导部位就是前S1蛋白的氨基端21～47肽段，前S1/AA21～47区段比较保守，只要这一段完整，变异的病毒就具有传染性［4］。目前，提高疫苗免疫原性的主要策略是在构建HBV主蛋白疫苗的基础上加入其他蛋白成分，如前S1蛋白、前S2蛋白以及C蛋白等［5-6］。

本研究根据外膜蛋白的跨膜特性，将大外膜蛋白人为地分为6段，设计了6对引物，经PCR扩增后，分别使扩增产物在前S1、前S2编码区的5'端加入尿激酶原的信号肽序列，并加入了组氨酸(His)标签和血细胞凝集素(HA)标签的编码序列。这6段扩增产物含有跨膜区的编码序列。由于HBV前S1的氨基端锚定于细胞膜上，本研究设计PCR扩增产物不含有前S1蛋白氨基端前11个氨基酸的编码区。构建好的载体转染人肾上皮293细胞，通过绿色荧光染色，Western印迹及激光共聚焦等方法检测蛋白在细胞内外的表达情况［7-9］。

1 材料与方法

1.1 载体、菌株和细胞系

含乙肝病毒外膜前S1、前S2和主蛋白基因序列的pcDNA3.1载体及293细胞株均由军事医学科学院生物工程研究所保存，真核表达载体pIRES2-EGFP、大肠杆菌Trans10 Chemically Competent Cell购自全式金生物技术有限公司，引物由华大基因有限公司合成。

1.2 试剂

高保真Pyrobest聚合酶、T4 DNA连接酶及T4 DNA聚合酶购自大连宝生物生物工程有限公司;限制性内切酶XhoⅠ，EcoRⅠ购自NEB公司;DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取、DNA产物纯化试剂盒购自Tiangen公司;Lipofectamine 2000和G418购自Sigma公司;山羊抗人IgG-HRP抗体、Hoechst33342荧光抗体、CF555驴抗鼠IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司;LB培养基各组分购自Oxoid公司。

1.3 细胞培养条件

细胞培养基为含有5%加强型小牛血清的DF完全培养基，于含5%CO2的37℃温箱进行细胞培养［3，10］。

1.4 引物的设计与合成

根据文献报道［11］及计算机模拟，设计合成6段HBV表面抗原跨膜基因，使表达产物含有四次跨膜区。设计思路见图1。以含乙肝病毒外膜前S1、前S2和主蛋白基因序列的pcDNA3.1载体为模板，对已设计的6段乙肝病毒外膜基因进行PCR扩增，所有上游引物均相同，同时为了克隆方便，在上游加入酶切位点XhoⅠ，下游加入酶切位点EcoRⅠ。引物序列见表1。引物合成由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。

Fig.1 Designed six fragments of HBV surface antigen for transmembrane.A:computer simulation schematic diagram of HBSAg transmembrane.B:the six fragments of HBV surface antigen base on the HBSAg transmembrane schematic diagram.

Tab.1 Primers used PCR procedure

1.5 Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg-HA基因扩增

PCR反应总体系为50 μl，其中含有10 μl 5×Pyrobest缓冲液、5 μl dNTPs 2.5 mmol·L-1、1 U Pyrobest聚合酶、2 μl 10 μmol·L-1上、下游引物、2 μl模板DNA。反应条件:95℃预变性2 min;95℃，20 s，60℃，20 s，72℃90 s，30个循环;72℃，5 min，4℃保存试。1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，经PCR产物回收剂盒纯化目的基因，4℃保存备用。

1.6 重组载体pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×HispreS1-preS2-HBsAg-HA的构建及酶切鉴定

用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切上述PCR回收目的产物，纯化HBsAg1～HBsAg6各基因片段，将双酶切后的目的基因与同样处理的质粒pIRES2-EGFP按照摩尔比3∶1混合，室温孵育30 min，将连接产物转化大肠杆菌Trans10，菌液涂布于含卡那霉素(100 mg·L-1)的LB固体培养基上，37℃倒置培养12～16 h，从平板上分别挑取单个克隆加入6 ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200 r·min-1摇床培养12 h后用质粒小提试剂盒提取质粒。质粒用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，酶切产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定，筛选插入目的条带正确的阳性质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定，测序结果用DNAman软件进行比对以验证目的片段序列的正确性，最终构建的表达载体如图2。

Fig.2 pIRES2-EGFP dicistronic expression vector with Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA gene sequence.

1.7 质粒转染293细胞及阳性克隆的初步筛选

将构建好的pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×HispreS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA质粒转染293细胞，按照Lipofectamine 2000阳离子脂质体转染试剂盒说明书进行:取测序正确的质粒1μg进行转染，用G418(500 mg·L-1)加压筛选，培养约2周，待细胞形成明显单克隆后，荧光显微镜下观察，转染成功的克隆细胞形态良好，并均匀分布发绿色荧光，未转染成功的细胞不发绿色荧光，挑取阳性单克隆扩大培养。

1.8 Western blotting鉴定转染质粒的293细胞阳性克隆

为了进一步明确pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×HispreS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA在293细胞内的获得表达，将绿色荧光阳性的细胞裂解，裂解液稀释100倍后做SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，用5%脱脂奶粉于4℃封闭过夜，一抗用鼠抗HA抗体37℃轻摇1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，二抗用HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体37℃轻摇1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，用化学发光法显色5 min，压片显影，具体操作参照Ida等［12］的方法。将阳性克隆细胞扩大培养后冻存备用［13-14］。

1.9 细胞免疫双标法检测细胞膜蛋白及定位

用免疫双标法对膜蛋白进行精确定位。将生长状态良好的细胞稀释为密度1×108L-1接入激光共聚焦专用培养皿中，有血清DF培养基培养24 h，观察皿内生长状态良好的单层或是单个细胞，用20 g·L-1甲醇固定细胞10 min，冰冷的1×PBS清洗，6%BSA 37℃封闭1 h后，冷PBS清洗2次，用1%BSA稀释一抗HRP标记的鼠抗HA抗体，37℃孵育1 h后，冷PBS清洗3次，每次5 min，加入二抗CF-555驴抗鼠IgG红色荧光标记，37℃孵育1 h后，冷PBS清洗3次，每次5 min，充分洗涤后加入Hoechst33342蓝色荧光标记染细胞核15 min，冷PBS清洗3次，每次5 min，用空293细胞作为阴性对照，荧光显微镜观察。

2 结果

2.1 Pro-UK-6×His-preS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA基因的扩增

HBsAg1～6的PCR结果如图3，HBsAg1～6片段的理论值分别为600，810，957，1098，1194和1275 bp，每条带之间差别较小，电泳片段大小符合理论值，此实验结果表明，含有前S1、前S2蛋白的HBsAg(1～6)共六段真核表达载体构建成功。

2.2 重组载体pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×HispreS1-preS2-HBsAg(1～6)-HA酶切鉴定和测序鉴定

重组质粒用XhoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，酶切产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳结果见图4。可见质粒大片段条带和各大小不同的目的基因片段条带，此验证实验结果表明了含有前S1、前S2蛋白的HBsAg(1～6)共6段真核表达载体构建成功。酶切鉴定正确的重组质粒样品送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序鉴定，测序结果与预期序列完全一致(测序结果略)。

Fig.3 Products of HBsAg1－HBsAg6 observed by PCR.M:DNA marker DL4500;lanes 1-6:HBsAg1-HBsAg6.

Fig.4 Double enzyme digestion products of the recombinant plasmids observed by PCR.M:DNA marker DL4500;lanes 1-6:pIRES2-EGFP-pres1-pres2-HBsAg(1-6)-HA.

2.3 重组载体质粒在293细胞中的表达

荧光显微镜下(图5)可见经转染和单克隆筛选后得到转染成功的HBsAg1～6的293细胞，呈亮绿色，细胞形态良好，荧光表达强度高;没有转染成功的细胞经G418加压筛选期间部分死亡，小部分不发荧光。经Western印迹进一步验证(图6)，蛋白在细胞上均有特异性表达，在预期大小相对分子质量(Mr)31 000，34 000，44 000，47 000，54 000和60 000处有明显的阶梯状蛋白信号，条带清晰并与理论值相一致。

2.4 重组载体质粒在293细胞膜蛋白的定位

基因HBsAg1～HBsAg6六个片段相互衔接构成基因全长，各片段之间累加形成一条长链贯穿于细胞膜内外，故选取基因全长HBsAg6片段为例，观察构建成功的长链细胞外膜蛋白在细胞内的定位，图7A中可看到外膜蛋白有清晰的表达，正常293细胞为阴性对照(图7B)。

Fig.5 Transfection of recombinant plasmids to 293 cells under fluorescent microscope(×40).A-F:HBsAg1-HBsAg6.

Fig.7 Transfection of HBsAg1－HBsAg6 to 293 cells observed by Western blotting.M:marker;lanes 1-6:HBsAg1-HBsAg6.

Fig.7Transfection of pIRES2-EGFP/Pro-UK-6*His-preS1-preS2-HBs6Ag-HA to 293 cells under confocal laser microscope(×1000).A:transfected 293 cells;B:normal 293 cell.

3 讨论

乙肝病毒的外膜蛋白在病毒颗粒分泌、附着及入侵新细胞中具有重要的介导作用，而且3种外膜蛋白均有较多的抗原表位。因此，构建同时含有preS1和preS2的蛋白可以更好地诱导机体的免疫应答。

Neurath等［15］报道的观察结果如下:一个短的包含前S1区第21位至第47位氨基酸(对应于基因型D，E，G的第10位至第36位氨基酸)的表面蛋白片段与HepG2细胞结合，并最终完成乙肝病毒与这些细胞的结合。前S1区包含主要的细胞黏附抗原表位，也有报道在前S1区外也有抗原表位，它们也参与乙肝病毒-细胞黏附过程。此外，识别前S2区或S区内抗原表位的抗体对感染具有抑制作用［16］。但是，这些抗体是通过直接遮盖乙肝病毒-细胞黏附的重要序列发挥作用，还是它们的结合可发挥间隔物作用，从而阻碍病毒和细胞表面之间的紧密接触，目前还不清楚。

本研究从含有乙肝外膜蛋白基因的质粒中扩增出S1和S2，与pIRES2-EGFP载体进行酶切连接，构建了能共表达乙肝前S1抗原、S2抗原、HBsAg和EGFP的真核表达载体。研究表明，乙肝表面抗原有3～4次跨膜特性，且前S1抗原、S2抗原参与前两次跨膜，与文献的报道一致［17-19］。

与目前我国使用的重组人S抗原的酵母/CHO基因工程疫苗相比，本共表达蛋白加入了S1抗原和S2抗原，可以提高其免疫原性，弥补了目前乙肝疫苗存在的抗体应答水平和人群免疫保护率低下等不足。这为研究乙肝病毒与细胞的相互作用提供了依据，也为研究比较各段跨膜蛋白及HBsAg的抗原性，为下一步设计在哺乳动物细胞中分泌性表达含有前S1抗原和S2抗原的更有效的乙肝疫苗奠定了基础。

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Construction of preS1-preS2-HBsAg of eukaryotic expression vector and its transmembrane property in 293 cells

NIU Ming-fu1*，JI Ping1，2*，WU Han-liang1，SHAO Yong2，GAO Li-hua2，HU Xia-men2
(1.College of Food and Bioengineering，Henan University of Science and Technology，Luoyang471003，China;2.Institute of Biotechnology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing100071，China)

OBJECTIVETo study the transmembrane properties of preS1-preS2-HBsAg of hepatitis B virus.METHODSDevided the large envelope protein(L protein)into six fragments according to its computer simulation structure model to design six pairs of primers(named HBsAg1-6).Final accumulation into a continuous length of chain which could form the four transmembrane domain in the cells inside and outside.The preS1 and preS2 fragments were amplified from the plasmid pcDNA3.1-preS1-preS2-HBsAg.And we linked pro-urokinase signal peptide(pro-UK)with 6×histidine(6×His)，HBsAg(1-6)and hemagglutinin(HA)by overlapping extension PCR method.The PCR products were double digested with XhoⅠand EcoRⅠand cloned into the expression vector pIRES2-EGFP.The constructed expression vectors were pIRES2-EGFP/Pro-UK-6×HispreS1-preS2-HBsAg(1-6)-HA，and they could coexpress preS1-preS2-HBsAg(1-6)，GFP and HA theoretically.The vectors were transfected into 293 cells respectively using Lipofectamine method.The positive clones were screened by G418 pressure.The expression of preS1-preS2-HBsAg(1-6)was detected using fluorescence observation，Western blotting and immune double labeling method indirectly.RESULTSPCR results showed that，the size of electrophoresis fragment in line with the theoretical value of HBsAg 1-HBsAg 6 fragments which are 600，810，957，1098，1194 and 1275 bp.The restriction endonuclease digestion of recombinant plasmid sequencing results was entirely consistent with the expected sequence.Get 293 cells which were successfully transferred of HBsAg 1-HBsAg 6 after transfection and monoclonal antibody screening.The cells were bright green，in good shape，and with high fluorescence expression intensity.Western blotting results showed that，there was ladder-like protein signaling on relative molecular mass of 31 000，34 000，44 000，47 000，54 000 and 60 000.Clear bands were consistent with the theoretical value.CONCLUSIONEukaryotic expression vectors are successfully constructed，the vectors contain Pro-UK，6×His，preS1，preS2，HBsAg(1-6)and HA genes.And the 293 cell lines which could coexpress HBsAg(1-6)，GFP and HA proteins are obtained.

eukaryotic expression vector;pIRES2-EGFP;hepatitis B virus membrane protein;293 cell

The project supported by National High Technology Research and Development Program(863 Program)(81201)

HU Xian-wen，E-mail:huxianwen@163.com，Tel:(010)66948820

R966

A

1000-3002(2012)06-0810-06

10.3867/j.issn.1000-3002.2012.06.006

*Jiont-first authors

2012-01-09接受日期:2012-04-09)

(本文编辑:乔虹)