离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐对斜生栅藻的毒性效应

段 炼,杜 耀,陆秋琳,蔡卫丹,方治国,刘惠君 (浙江工商大学环境科学与工程学院,浙江 杭州 310012)

一种新型的“绿色溶剂”—离子液体因具有极低的蒸汽压、不挥发、导电性强、对许多无机盐和有机物有良好溶解性等诸多优点使之在分离过程、电化学和化学反应等领域显示出广阔的应用前景[1].然而离子液体的结构与其毒性和生态效应存在相关性[2],离子液体的化学和热力学稳定性导致其在环境降解、残留和生态效应等方面具有潜在环境风险,近年来其环境行为及生态毒性引起了研究者的关注[3],在离子液体对大型蚤、斑马鱼、蚯蚓、卤虫的急慢性毒性影响及酶活性等方面做了相关研究[4-7].

由于离子液体较好的水溶性,其对水环境的影响不容忽视[3].近年来离子液体对绿藻、大型蚤和斑马鱼生物生长抑制率的影响已有研究报导[8-10].然而目前对于咪唑氯盐离子液体对藻类影响的研究较少.本文研究 1-丁基-3-甲基咪唑氯盐([BMIM]Cl)对斜生栅藻的影响,从 IC50、叶绿素含量、酶活性、细胞通透性以及藻细胞超微结构的观察等5个方面,获得供试离子液体对藻类影响的参数,为认识和评价离子液体环境安全性提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 藻种及培养条件

斜生栅藻(S.obliquu)购自中国科学院武汉水生生物研究所国家淡水藻种库(FACHB).将藻种接种至灭过菌的水生 4号(HB-4)人工培养液[11]中,于SPX智能型可编程光照培养箱恒温光照培养.培养条件:用4层纱布封口以防污染,培养温度为25℃,光照63μmol/(m2·s),光暗比为16h:8h.每天定时摇动3次.

1.2 主要试剂

1-丁基-3-甲基咪唑氯盐([BMIM]Cl)购自中国科学院兰州化学物理研究所绿色化学与催化中心,纯度为99%;考马斯亮蓝和牛血清白蛋白购自上海生工生物工程有限公司;TEM样品包埋剂为SPI-CHEM Spurr resin,产自美国;其他试剂均为分析纯;水为二次亚沸蒸馏水.

1.3 实验方法

取 100mL浓度为 3.5×105个/mL的藻液, [BMIM]Cl处理浓度为 0,20,40,80,120,180, 250mg/L,调节 pH8.0,每一处理设置3组平行.实验分2批处理,第1批每天定时测定生物量,96h后测叶绿素含量,另1批培养96h后测定过氧化氢酶活性、超氧化物歧化酶活性、细胞通透性,取对照及中浓度 80mg/L[BMIM]Cl处理的藻液进行细胞超微结构观察.

1.4 分析测定方法

1.4.1 生长抑制 采用显微镜下血球计数板进行计数,并在波长680nm下测定斜生栅藻光密度,建立不同藻细胞浓度和光密度之间的关系. [BMIM]Cl对藻的抑制率=100%×(对照组生物量-处理组生物量)/对照组生物量[12].采用 Logistic模型对浓度-抑制率之间的关系进行拟合,计算相应的IC50值[13].

1.4.2 叶绿素含量 取60mL藻液3000g离心10min后加90%丙酮,摇匀,在低温暗处抽提24h,在3000g离心10min后取上清液,在750nm处调零以扣除溶液中悬浮液的吸光值,采用Humphrey和Jeffrey公式计算叶绿素a和叶绿素b的含量[14].

1.4.3 氧化应激 取 60mL藻液在 4℃,6000r/ min下离心 10min;弃去上清液,加入 10mL的50mmol/L磷酸缓冲液,用超声波细胞破碎仪破碎藻细胞(破碎条件:功率800W,破碎3s,间隔10s,破碎20次);在4℃,15000r/min下离心10min,取悬浮液在-80℃冰箱中保存.过氧化氢酶 (CAT)参照 Aebi等[15]的方法测定,超氧化物歧化酶(SOD)用氮蓝四唑法(NBT法)[16]测定.

1.4.4 细胞通透性影响 参照 Vigneault等[17]的方法研究[BMIM]Cl对藻细胞通透性的影响.向藻液(藻细胞密度为 7.0×105个/mL)中移取适量荧光素二乙酸甲酯(FDA)溶液使其浓度为3.0×10-6mol/L.用荧光分光光度计测定FDA加入后10min内的水解速率,在没有藻液的空白溶液中1h内FDA没有水解.溶液荧光强度随时间变化的线性方程的斜率为水解速率,以此反应藻细胞的通透性.

1.4.5 透射电镜观察 分别取 96h的对照、80mg/L[BMIM]Cl处理的藻液,3000r/min离心后收集的藻体用于细胞超微结构观察.用2.5%的戊二醛固定12h后,用磷酸缓冲液漂洗3次;再用锇酸固定,酒精梯度脱水后,用丙酮梯度脱水;包埋剂浸透后包埋12h,36℃到60℃聚合后修块,切片后染色,水洗,干燥,最后在日立Model H-7650透射电镜下观察斜生栅藻的超微结构[13].以上工作在浙江大学生物电镜室完成.

1.5 数据处理与分析

所有数据统计分析用Origin8.0软件处理.

2 结果与讨论

2.1 [BMIM]Cl对斜生栅藻生物量的影响

在处理后24h时,[BMIM]Cl对斜生栅藻的生长抑制作用不明显,低浓度处理组对斜生栅藻的生长反而有一定的促进作用,20和40mg/L的处理抑制率分别为-3%、-4%,高浓度(250mg/L)对斜生栅藻的生长抑制率也仅为25%.由图1可以看出,低浓度处理组的斜生栅藻的生长随着时间的延长抑制率降低,40mg/L处理48,72,96h的抑制率分别为23.8%、15.8%和7.6%,表现出低浓度处理下生长的恢复.而高浓度处理组,抑制率随着培养时间的延长逐渐增大,250mg/L处理组48,72,96h的抑制率分别为67%、78%和84%.通过斜生栅藻的生长抑制率计算得IC50(表1),随着培养时间的延长IC50值减小, 48h IC50、72h IC50和96h IC50分别为103.77,76.44,68.49mg/L.

图1 采用Logistic模型拟合的浓度-抑制率之间的关系曲线Fig.1 Concentration-response fitting curve using the Logistic model

表1 Logistic模型参数和预测的IC50值Table 1 Parameters of the Logistic model and the IC50

不同的离子液体对藻类的毒性不同,李俊峰等[18]研究了 6种咪唑类离子液体对斜生栅藻的毒性效应,发现烷基取代链长度的增加将增大其对斜生栅藻的毒性.本实验在固定藻的培养条件下,[BMIM]Cl的毒性随着时间的延长而增强,表现为抑制率增加,IC50值减小.

2.2 [BMIM]Cl对斜生栅藻叶绿素含量的影响

叶绿素作为植物进行光合作用的主要色素,其含量高低能够反映出光合作用水平的强弱[19]. [BMIM]Cl处理后96h斜生栅藻的Chla和Chlb含量的变化趋势与其生物量的变化趋势一致(表2),低浓度处理组Chla和Chlb的含量低于对照组但没有达到显著水平(P＞0.05),经 20和 40mg/L处理的藻细胞Chla的含量分别是对照的95.2%和 88.0%;随着[BMIM]Cl浓度的增加,Chla和Chlb含量总体呈下降趋势,180、250mg/L处理组Chla的含量分别是对照的 31.3%和 26.5%,与对照相比差异达到显著水平(P＜0.05).Chlb含量的下降趋势与 Chla含量下降趋势一致.[BMIM]Cl浓度的升高导致藻细胞生长受抑制,Chla和Chlb的浓度下降.这可能是因为[BMIM]Cl进入藻细胞内部产生活性氧,细胞内活性氧的积累导致叶绿素和叶绿体结构破坏,通过对藻细胞超微结构的观察,发现[BMIM]Cl对叶绿体片层结构产生一定影响,从而降低叶绿素合成相关酶的活性,叶绿素合成受阻致使藻细胞内叶绿素含量减少,在实验后期也可以观察到高浓度处理的藻体溶液变白.

表2 [BMIM]Cl处理96h后斜生栅藻Chla和Chlb含量Table 2 The chlorophyll a and chlorophyll b content of S. obliqnus after 96 h [BMIM]Cl exposure

2.3 [BMIM]Cl对斜生栅藻CAT和SOD活性的影响

由图2a可知经[BMIM]Cl不同浓度处理,斜生栅藻CAT活性整体呈现减小的趋势.在低浓度处理组(20mg/L),CAT酶活性是对照的99.7%,与对照相比没有达到显著水平.80mg/L处理组CAT酶活性是 0.048U/mg蛋白,经 180、250mg/L [BMIM]Cl处理的藻细胞CAT活性降低到0.024和0.017U/mg蛋白,分别是对照组(0.070U/mg蛋白)的34.3%和24.3%.与对照相比,[BMIM]Cl处理对斜生栅藻细胞的SOD活性表现为低浓度激活高浓度抑制(图2b).在20mg/L实验组,SOD活性是对照组102.8%,与对照相比没有达到显著水平.随着处理浓度的增加 SOD活性减小,当处理浓度达到180,250mg/L时,SOD活性分别是对照的62.5%和57.0%.

图2 [BMIM]Cl处理96h后斜生栅藻CAT和SOD活性Fig.2 Catalase and Superoxide Dismutase activity of S. obliqnus after 96h [BMIM] Cl exposure

不同的环境胁迫下如重金属、农药等都会影响生物的生长,这些影响因素可能会产生一些活性氧自由基(ROS),ROS如不能够及时清除,聚集在生物体内会破坏生物体内的蛋白质、核酸和脂类等,对生物产生损害作用[20].ROS能够诱导抗氧化酶系的活性,超氧自由基在 SOD的催化下与氢离子结合,生成过氧化氢,过氧化氢在过氧化氢酶作用下生成水和氧气[21].已有报道证明污染物对藻细胞抗氧化酶系的影响[22].本研究中低浓度处理对SOD与CAT活性影响不大并表现出一定程度的增大,表现出对[BMIM]Cl处理的氧化应激反应,这可能是斜生栅藻表现出的应对[BMIM]Cl影响的一种保护机制;在高浓度处理组,斜生栅藻生长受到抑制,酶活性受到影响而降低.

2.4 [BMIM]Cl对斜生栅藻细胞通透性的影响

图3 [BMIM]Cl处理96h后斜生栅藻的细胞通透性Fig.3 Cell permeability of S. obliqnus after 96h [BMIM] Cl exposure

没有荧光活性的荧光素二乙酸甲酯(FDA)可被体内的脂酶代谢生成具有荧光活性的荧光素[23],FDA难以通过完整的细胞膜,因此荧光素的荧光强度可用以表征细胞膜的完整性和通透性[24-25].单位时间内测定的荧光强度越大,表明藻类细胞的代谢活性越高,细胞膜的通透性越强[26]. [BMIM]Cl对藻细胞通透性的影响如图 3所示. [BMIM]Cl增加了斜生栅藻的细胞通透性. 20mg/L[BMIM]Cl处理的藻细胞通透性为对照的1.5倍,随着浓度的升高,这种刺激效应更加明显.高浓度处理显著增加了细胞通透性,当处理浓度增加为 120,180mg/L时,藻细胞的通透性分别为对照的5.7和7.4倍.

2.5 斜生栅藻的细胞超微结构观察

图 4是对照(图 4A1和 4A2)和 80mg/L [BMIM] Cl处理(图4B1、4B2、4B3和4B4)的藻细胞超微结构图.在对照全景图(图 4A1)中有许多完整的单个细胞,呈椭圆形和纺锤形,排列比较密集.在图4A2中的藻细胞有完整的细胞壁,致密厚实的细胞膜.叶绿体环绕细胞并占了大半的细胞容积,叶绿体中可以看到清晰的片层结构.线粒体数量较多且内部结构完整,脊较明显,基质电子密度高.圆形蛋白核完整,核仁和核质清晰.

在80mg/L[BMIM]Cl处理的藻中,全景图(图4B1)观察到一些藻细胞形态发生了改变,数量明显减少.在单个细胞中可以明显观察到质壁分离现象(图4B4),图4B2、4B3中叶绿体的片层结构断裂且层次不清晰,还有一些脂质球体分布在叶绿体内(图4B3、4B4).可以观察到有些线粒体大小正常但嵴的数量增多(图 4B2),还有一些线粒体变形肿胀,嵴却减少(图4B3、4B4),线粒体内还可以看到清晰的膜间隙,在液泡中存在一些沉淀物质(图4B2、4B4).

图4 80mg/L[BMIM]Cl处理96h后斜生栅藻细胞透射电子显微镜观察Fig.4 Transmission electron micrographs of S. obliquus cells after 96 h in 80 mg/L[BMIM]Cl treatment

研究表明,逆境条件对藻类细胞有毒害作用,使得藻细胞变形、破裂,胞壁和原生质体结合疏松,对藻细胞超微结构中叶绿体、线粒体等结构毒害较大[22,27].咪唑类化合物的结构和阳离子表面活性剂相似,[BMIM]Cl是一端亲水(咪唑端)一端亲油(烷基端)的两亲分子.表面活性剂对藻类的作用主要是能引起膜脂结构的破坏和组成的改变[28].[BMIM]Cl对斜生栅藻的影响与表面活性剂的影响类似,通过TEM观察,[BMIM]Cl引起藻细胞的质壁分离,[BMIM]Cl透过细胞壁,渗透到含有大量脂类的细胞膜中,影响了细胞的正常生长.[BMIM]Cl进入细胞后破坏了叶绿体的结构,导致叶绿体的片层结构断裂,叶绿素含量下降,影响了光合作用的进行.脂质球体的变化可以反映出细胞在胁迫条件下的受伤害程度[29],TEM观察发现 80mg/L[BMIM]Cl处理的藻细胞叶绿体内分布有脂质球体(图 4B3和 4B4).线粒体作为有氧呼吸产生能量的主要场所,是对各种损伤最为敏感的细胞器之一,为了获得代谢所需的能量,线粒体承担了更重的任务从而引发了病变.本研究观察到线粒体嵴数量的减少以及嵴肿胀,[BMIM]Cl可能对藻细胞的能量转换系统产生影响,从而阻碍物质和能量的传递,影响藻正常的生长代谢.

3 结论

3.1 在试验浓度范围(0,20,40,80,120,180,250mg/L)内,随着浓度的增大,[BMIM]Cl对斜生栅藻的生长抑制作用增强,导致藻类叶绿素含量下降.

3.2 [BMIM]Cl低浓度(20mg/L)处理组,斜生栅藻的SOD与CAT活性增大,表现出对[BMIM]Cl处理的氧化应激反应;随着[BMIM] Cl处理浓度的增加,斜生栅藻的SOD与CAT活性下降.

3.3 [BMIM]Cl破坏了斜生栅藻细胞膜,随化合物浓度增加细胞通透性增强.

3.4 暴露于80mg/L[BMIM]Cl溶液中,斜生栅藻细胞的超微结构受到了影响,造成质壁分离,叶绿体片层断裂,线粒体嵴数量减少.

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