＊ 五味子乙素对染矽尘大鼠肺组织MMP－2和TIMP－2蛋白表达的动态影响

郭民，樊林花，陈朝阳，刘田福

（山西医科大学 实验动物中心，山西 太原 030001）

＊五味子乙素对染矽尘大鼠肺组织MMP－2和TIMP－2蛋白表达的动态影响

郭民，樊林花，陈朝阳，刘田福＊

（山西医科大学 实验动物中心，山西 太原 030001）

为研究五味子乙素（Sch－B）对二氧化硅致大鼠矽肺中基质金属蛋白酶（MMP－2）和其抑制物基质金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP－2）的作用，采用暴露式气管内注入SiO2混悬液法建立大鼠矽肺模型，染毒后1 d开始灌胃给予Sch－B干预治疗，药物干预3 d、7 d、14 d和28 d后处死取其肺组织.应用HE、Masson染色法观察肺组织病理改变及肺组织胶原纤维变化；通过ELISA法对大鼠肺组织中不同时间点的MMP－2、TIMP－2蛋白的表达情况进行了研究.结果表明：Sch－B对矽肺组织纤维化病变有明显的改善，胶原纤维明显减少.Sch－B对二氧化硅致大鼠矽肺中不同时间点肺组织MMP－2的表达均有一定程度的抑制作用，早期肺泡炎时可一过性提高TIMP－2的表达，起到抑制MMP－2对肺组织损伤的作用，后期抑制TIMP－2的表达，减缓肺组织纤维化的发生.

五味子乙素；二氧化硅矽肺；MMP－2、TIMP－2；大鼠

矽肺是由于长期大量吸入游离SiO2诱发肺组织损伤，引起肺组织细胞外基质（extra cellularmatrix，ECM）蛋白大量沉积，从而导致肺组织特征性病灶，矽结节的形成和肺组织弥漫性纤维化［1］.近年研究表明，基质金属蛋白酶（MMPs）及其特异的组织抑制剂（TIMPs）在肺损伤与修复以及肺间质纤维化形成过程中起着重要的调节作用，活化的MMPs／TIMPs的失衡可导致细胞外基质代谢紊乱［2－8］.笔者前期实验发现，Sch－B对矽肺大鼠纤维化有较好的抑制作用.本实验通过动态观察Sch－B对染矽尘大鼠金属蛋白酶－2（MMP－2）和金属蛋白酶组织抑制剂－2（TIMP－2）的蛋白表达，验证五味子乙素对染矽尘大鼠肺组织的作用机制，揭示五味子乙素可能的作用机理，为临床用药提供依据.

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物

清洁级Wistar大鼠96只，雌雄各半，体重（200±20）g，由山西医科大学实验动物中心提供，实验动物质量合格证明书编号：100026.

1.1.2 主要试剂及仪器

五味子乙素购于成都曼斯特生物科技有限公司，HPLC＞98%，批号：110765；试剂：SiO2购于美国Sigma公司，纯度99%，粒子大小范围在0.5－10μm之间，80%的粒子直径为1－5μm，批号：76K0020.用生理盐水配成50 mg／m L混悬液经高压蒸汽灭菌后，用前加青霉素20 000 U／m L.MMP－2和TIMP－2试剂盒由美国LD公司进口上海西塘生物科技有限公司分装批号：1012261和1012050.切片机（Laica RM2235）；显微镜（Olympus BX51）；酶标仪（美国Thermo Sciemtific MK3）.

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及矽肺模型的制备和肺组织标本的处理

将96只大鼠随机分为对照组（Control）32只、模型组（Model）32只、Sch－B干预组（Sch－B）32只，每组雌雄各半.用戊巴比妥钠（40 mg／kg）麻醉大鼠后，暴露大鼠气管，对模型组和Sch－B干预组大鼠气管内一次性注入1 m L矽尘混悬液（50 mg／m L），对照组大鼠同法气管内注入1 m L灭菌生理盐水.染尘后次日干预组开始灌胃给予Sch－B（80 mg／kg），其余各组给予等容橄榄油.每周复查体重，调整给药剂量.染尘后次日记为第1天，连续给药28 d.

分别在给药3 d、7 d、14 d和28 d时，随机取各组大鼠8只，经腹腔注射麻醉后，将整个肺脏从胸腔中取出，剔除气管、支气管等结缔组织，在生理盐水中漂洗.

1.2.2 HE和Masson染色法观察肺组织变化

取右肺中间叶（10%中性甲醛固定）及右肺下叶（Bouin氏液固定），经常规石蜡包埋、切片（4μm）后，用HE和Masson染色法染片，光镜下观察肺组织形态及胶原纤维变化.

1.2.3 MMP－2和 TIMP－2的检测

称取左肺200 mg，用眼科剪迅速剪碎后置玻璃匀浆器中加入预冷的生理盐水制成10%的肺组织匀浆液，1500 r／min，4℃，离心10 min，取上清检测MMP－2和TIMP－2蛋白含量.操作步骤均按ELISA试剂盒说明书进行.

1.3 统计学分析

所有资料均用SPSS 19.0统计软件分析，数据以¯X±S表示，相同时间点各组间的比较用两个独立样本比较的Wilcoxon秩和检验，P＜0.05认为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织形态及胶原纤维变化的观察结果

光镜下结果显示，对照组大鼠各时间点肺组织结构基本正常，偶见轻微炎症反应，支气管壁可见薄层胶原分布，肺泡间隔有少量纤细的胶原分布（图1A，P728）.第3天模型组病变多发于小、细支气管周围，表现小、细支气管黏膜肿胀，上皮细胞变性脱落，管腔内充有炎细胞和纤维素样物质，其周围肺泡间隔增宽，间质细胞明显肿胀，伴有巨噬细胞、炎细胞浸润和成纤维细胞增生，毛细血管扩张充血.局部可见肺泡腔内有纤维素、炎细胞、巨噬细胞、黏液组成的渗出物及由上皮样细胞包裹的巨噬细胞聚集形成的圆形或不规则形肉芽肿，其内还含有少量淋巴细胞和中性粒细.该部位肺泡结构已破坏不完整，细胞性结节形成.支气管壁周围及肺泡间隔胶原沉积较对照组有所增多（图1B）.干预组肺泡结构基本正常，间质内细胞轻度肿胀、增生，偶见肺泡腔内有黏液样物质渗出及巨噬细胞和成纤维细胞浸润.支气管壁周围及肺泡间隔胶原沉积接近正常（图1C）.第7天模型组大鼠肺泡间隔显著增厚，肺间质有较多炎细胞、巨噬细胞浸润及成纤维细胞增生，肺泡腔内小肉芽肿弥漫存在，与周围萎缩的肺泡腔及相邻肉芽肿合并融合成较大的肉芽肿，伴成纤维细胞增生，局部有胶原纤维增生，形成含胶原纤维的细胞结节.支气管壁周围及肺泡间隔胶原沉积明显增多（图1D）.干预组间质巨噬细胞有浸润、成纤维细胞增生较少，肺泡腔内小肉芽肿弥漫存在，与周围萎缩的肺泡腔及相邻肉芽肿合并形成肉芽肿较模型组减小，肉芽肿及肺泡间隔内形成的胶原纤维较模型组减少（图1E）.第14天模型组大鼠肺间质成纤维细胞增生严重，细胞结节继续增大，纤维化进行性加重，肺泡间隔断裂现象较严重，胶原呈小片状或呈小束状（图1F）.干预组大鼠肺间质成纤维细胞增生减轻，胶原纤维较模型组较少（图1G）.第28天，模型组大鼠肺泡结构破坏或消失，肺组织以胶原沉积、肺纤维化改变为主，可见巨大纤维性结节（图1H）.干预组症状较模型减轻，胶原纤维明显较少（图1I）.

2.2 各组大鼠肺组织中各个时间点MMP－2蛋白表达的变化

模型组第3天时，MMP－2表达即明显升高，1－2周时达到高峰，以后表达逐渐降低，但仍明显高于对照组（P＜0.01）.干预组与对照组比较均高于对照组（P＜0.01）.干预组与模型组比较，各时间点均低于模型组（P＜0.01）（表1，P728）.

2.3 各组大鼠肺组织中各个时间点TIMP－2蛋白表达的变化

模型组各时间点TIMP－2表达均明显高于对照组（P＜0.01），且成逐渐增高趋势.干预组与对照组比较，各时间点TIMP－2的表达也均明显升高（P＜0.01）.干预组与模型组除28 d低于模型组外，其余均高于对照组（P＜0.01）（表1）.

图1 不同时间点大鼠肺组织形态及胶原纤维变化的结果（HE染色、Masson染色，×200）注：A：3天对照组（HE染色）；B：3天模型组（HE染色）；C：3天干预组（HE染色）；D：7天模型组（Masson染色）；E：7天干预组（Masson染色）；F：14天模型组（HE染色）；G：14天干预组（HE染色）；H：28天模型组（Masson染色）；I：28天干预组（Masson染色）；Fig.1 Results of HE staining for lungs and Masson staining for collagen fibers of rats on different time points（HE staining、Masson staining，×200）Note：A：3d，control group（HE staining）；B：3d，Model group（HE staining）；C：3d，Sch－B treated group（HE staining）；D：7d，Model group（Masson staining）；E：7d，Sch－B treated group（Masson staining）；F：14d，Model group（HE staining）；G：14d，Sch－B treated group（HE staining）；H：28d，Model group（Masson staining）；I：28d，Sch－B treated group（Masson staining）

表1 不同时间点大鼠肺组织中MMP－2、TIMP－2蛋白的表达Table 1 Dynamics of MMP－2 ＆TIMP－2 protein in lung of rats （n＝8±S，单位：pg／mg）

表1 不同时间点大鼠肺组织中MMP－2、TIMP－2蛋白的表达Table 1 Dynamics of MMP－2 ＆TIMP－2 protein in lung of rats （n＝8±S，单位：pg／mg）

Group 3 d 7 d 14 d 28 d Protein MMP－2 Control 154.50±1.87 213.01±4.87 211.05±2.5 171.00±2.24 Model 239.04±1.90★ 334.22±3★ 345.76±3.6★ 239.98±4.4★Sch－B 173±11.1★▲ 282.81±14.18★▲ 304.18±21.57★▲ 203.66±25.29★▲TIMP－2 Control 23.54±0.14 22.32±0.23 20.94±0.18 23.32±0.28 Model 32.09±0.11★ 32.44±0.2★ 33.13±0.22★ 42.99±0.36★Sch－B 42.06±0.55★▲ 40.46±0.57★▲ 34.62±0.66★▲ 35.37±0.3★▲注：与对照组比较，★P＜0.01；与模型组比较▲P＜0.01

3 讨论

矽肺是在生产环境中长期吸入大量含游离二氧化硅粉尘微粒所引起的以肺纤维化为主的全身性疾病.其基本病变是特征性病灶矽结节的形成和弥漫性间质纤维化，而矽结节的形成和弥漫性间质纤维化的病理实质主要是机体损伤与修复失控导致ECM异常增多和过量沉积，使得肺脏结构与功能遭到破坏［1］.因此，深入研究其发病机制与防治措施具有重要的理论意义与临床价值.本实验采用暴露式气管内注入法染尘，诱导大鼠矽结节和肺纤维化形成.结果发现，染矽尘后3 d时肺泡肿胀、间隔已有大量巨噬细胞、炎症细胞浸润，并有细胞性结节形成；1－2周时肺泡间隔显著增厚，肺泡腔内小肉芽肿弥漫存在，已有含胶原纤维的细胞性结节的形成；4周时模型组大鼠肺泡结构破坏或消失，肺组织以胶原沉积、肺纤维化改变为主，巨大纤维性结节形成，说明造模成功.从HE和Masson染色结果上看，应用Sch－B干预后大鼠各时间点病理症状较模型组均减轻，说明Sch－B对SiO2导致的矽肺具有一定的抑制作用.

矽肺的发病机制目前尚未完全阐明，但多数学者认为肺泡巨噬细胞是SiO2粉尘作用的主要靶细胞，巨噬细胞吞噬吸入SiO2粉尘后，分泌多种炎性因子和致纤维化因子，引起肺组织损伤与修复失控，导致ECM异常增多和过量沉积［9－10］.近年来研究表明在ECM合成和降解的调节过程中，MMPs及其特异的组织抑制物（TIMPs）起着非常重要的作用［11－12］.MMPs是一类含锌的蛋白水解酶，以酶原形式分泌到细胞外，活化后其主要功能是降解ECM中的多种蛋白成分，而基质金属蛋白酶TIMPs对基质金属蛋白酶家族成员都有所抑制，也是一种多功能蛋白，它能够改变细胞的活动，及调整细胞基质的更新［5］.在体内活化的 MMPs和TIMPs之间存在一种平衡关系，正是这种平衡关系调节着ECM的降解.MMP－2是基质金属蛋白酶的家族成员，能通过分解Ⅳ型胶原蛋白及糖蛋白成分使肺基质成分降解，破坏肺泡壁结构的完整性，从而使成纤维细胞迁移到肺泡腔，造成肺泡腔内纤维化［13］.TIMP－2是MMP－2的主要抑制剂，多伴随其表达而出现.

本实验结果显示：模型组大鼠3 d时，MMP－2和TIMP－2蛋白的表达较正常，对照组已明显升高，但TIMP－2的升高远不及MMP－2升高明显.随着染矽尘时间的延长，MMP－2蛋白的表达量逐渐增加，染矽尘后1－2周时达到最高，2周后开始降低但仍高于对照组，而TIMP－2蛋白表达逐渐增加.研究结果提示：MMP－2和TIMP－2全程参与了肺纤维化的发生发展.早期由于TIMP－2的表达缓慢增加，使得活化MMP－2与TIMP－2的比值相对失衡，以MMP－2的表达为主，所以在这段时间，肺组织以炎症损伤为主，而ECM的积聚较少，后期由于TIMP－2的表达明显增加，抑制MMP－2活性，导致ECM降解减少，使得肺组织内的ECM过度增生和异常沉积增多形成肺纤维化.经五味子乙素预防后，干预组各时间点MMP－2的表达均较模型组有所减弱；而TIMP－2的表达，在3 d、7 d、14 d明显升高，28 d则低于模型组；这说明五味子乙素在矽肺早期能降低MMP－2的表达水平，同时能一过性提高TIMP－2的表达，从而起到降低MMP－2活性，减轻其对肺组织损伤的作用.14 d之后TIMP－2与MMP－2的表达虽然都降低，但从数据上看，TIMP－2的下降较MMP－2显著，从而相对提高了MMP－2的表达，对ECM降解增加，起到抑制纤维化的作用.其结果与HE、Masson结果相一致.

综上所述，本实验阐明了大鼠染矽尘后MMP－2与TIMP－2的动态变化规律及使用Sch－B后对其动态变化的影响，这为进一步选择合适时机干预矽肺纤维化进程提供依据.同时提示，Sch－B可在染矽尘大鼠中通过降低MMP－2的表达及早期一过性提高TIMP－2的表达与后期降低其表达两方面来完成对矽肺的防治作用.

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Effect of Schisandrin B on Dynamic Change of MMP－2 and TIMP－2 Expression in Rat Lungs Exposed to Silica

GUO Min，FAN Ling－hua，CHNE Zhao－yang，LIU Tian－fu
（LaboratoryofAnimalCenter，ShanxiMedicalUniversity，Taiyuan030001，China）

To investigate the effect of schisandrin B on expression and significance of matrix metalloproteinase（MMP－2）and tissue inhibitor of matrix metall oproteinase（TIMP－2）protein in silica induced pulmonary fibrosis model，the lung injury model was established by a single intratracheal injection of silica.From the first day of exposure of silica，the rats were treated with Sch－B and sacrificed on 3，7，14 and 28 d and lungs were collected.The histopathological of the lungs were observed by HE staining and changs of collagen fibers in the lungs were observed by Masson staining.The MMP－2 and TIMP－2 protein expression were determined by ELISA.The results show that compared with control group，Sch－B improved fibrosis of lungs and reduced collagen fibers.Sch－B could inhibit expression of MMP－2 protein in model rats at every time points，and improve expression of TIMP－2 at the initial stage of rat lungs exposed to silica.Sch－B can inhibit MMP－2 induced lung injury.Sch－B inhibited expression of TIMP－2 at the final stage and reduced pulmonary fibrosis.

Sch－B；silicosis；MMP－2、TIMP－2；rats

R－332；R135.2；Q5

A

2011－12－10；

2012－01－12

山西省实验动物专项基金项目（2007k03）；山西医科大学2011年大学生创新基金项目

郭民（1970－），男，实验师，主要从事人类疾病动物模型的病理学研究.E－mail：gm5647＠163.com.＊通讯作者：E－mail：ykdltf＠yahoo.com.cn

0253－2395（2012）04－0726－05