小鼠PP1 基因启动子克隆鉴定及潜在甲基化位点分析

颜波

(1.包头医学院第一附属医院风湿免疫科；2.包头医学院生物医学研究中心；3.包头医学院基础医学院，内蒙古 包头 014010； 4. 泰山医学院附属医院神经内科，山东 泰安 27100； 5.包头师范学院生物系，内蒙古 包头 014030)

Protein serine/threonine phosphatase-1 (PP1)是脑内表达丰富的一种蛋白磷酸酶，它有4种异构体(a、b、g和d)，PP1a主要存在于胞质，PP1b和PP1d同在胞质和胞核，PP1g主要存在于胞核。每一种异构体都有自己的一套底物[1]。在大脑中，在突触末端出现PP1的各种异构体的作用是负向调节神经元信号和突触强度，这些异构体的分子作用是抑制学习记忆。抑制PP1的活性，可以提高海马依赖的空间学习记忆能力[2-3]。大鼠PP1转录起始点上游有一300 bp的GC含量高达79%的区域，这一高GC区控制着PP1的转录[4]。PP1表达受其promoter区甲基化的影响，DNA甲基化增加使其表达量降低，并且DNMTs参与了其甲基化的改变[5]。有报道低氧可以诱导PP1的活性改变[6]。本研究利用高保真PCR 克隆了小鼠PP1基因的启动子区，为进一步构建特异表达载体及进一步研究其低氧预适应对转录表达调控，特别是低氧条件下甲基化对其表达调控的影响奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

昆明小鼠，Expand High Fidelity PCR System(Roche公司)，EZ DNA Methylation-Gold Kit(zymo公司), rTaq(Takara公司),基因组DNA提取试剂盒(康为世纪)，TA clone kit(invitrogen)，DH5α 菌种等。

1.2 引物设计

根据小鼠PP1基因上游序列设计引物，序列如下：PP1-F:ACTTCTGTCCCCAAGCAGCAGAGCC； PP1-R:GAGTGCAGCGGCCCGGCC。预期扩增产物为320 bp。

1.3 提取基因组DNA，PCR 扩增、T-A 克隆及测序

根据基因组提取试剂盒说明提取小鼠大脑中基因组DNA，将提取的基因组DNA用RNA酶消化后冻存备用。取0.5 μg基因组DNA作为模板，利用Expand High Fidelity PCR System进行扩增，扩增条件为94℃变性5 min; 94℃、30 s, 52℃、30 s, 72℃、30 s, 30个循环; 72℃延伸8 min。扩增结束后，加入rTaq及dNTP，72℃保温10 min，使PCR产物加上A。取1 μl PCR 产物，2 μl PCR-2.1载体在T4 DNA连接酶作用下连接16 h。转化感受态DH5α细菌，通过蓝白斑筛选阳性克隆，提取质粒，经酶切鉴定质粒，对含正确插入片断的质粒测序。

1.4 PP1启动子区DNA甲基化情况分析

如1.3方法提取基因组DNA，使用EZ DNA Methylation-Gold Kit将5-mC转变成T，取1 μl产物为模板，正向引物：CTTCCTCCTCCTCTCGCCACT，反向引物：GTTAGATTTTTGTTTTTAAGTAGTAGAGT，加入rTaq及dNTP进行PCR扩增。PCR产物如1.3进行TA克隆和测序。

1.5 PP1启动子区DNA甲基化位点及转录因子结合位点分析

利用ABI公司的Methyl Primer Express software V1.0软件，对克隆的序列进行CpG位点分析。利用转录因子结合位点预测软件TFSEARCH对PP1启动子序列的特征性分析。

2 结 果

2.1 小鼠PP1启动子克隆及鉴定

以人基因组为模板，通过特异性上游引物和下游引物进行PCR扩增，扩增后加上A后与PCR2.1载体经T4 DNA连接酶连接，连接产物转化感受态细菌。蓝白斑筛选挑取单克隆，扩大培养，提取质粒，经EcoRI酶切，琼脂糖凝胶电泳检查片段大小,可获得到0.3 kb左右和3.9 kb 左右2个目的片段(图1)。将酶切正确克隆送公司测序，测得序列与Genbank登记的人PP1基因启动子区完全相同即为正确的质粒(图2)。

图1 PCR2.1-小鼠PP1启动子区质粒EcoRI酶切电泳图

M：Marker；1：PCR2.1-小鼠PP1启动子区质粒EcoRI单酶切，切出0.3 kb和3.9 kb两个片段；2:空PCR2.1 质粒EcoRI酶，切出片段3.9 kb。

2.2 小鼠PP1启动子区(-320 bp～0 bp)DNA 甲基化状态

通过Bisulfite处理基因组后使5-mC转换成T，通过测序分析发现在PP1启动子区(-320 bp～0 bp)只有一个CpG二核苷酸被甲基化，结果显示小鼠PP1启动子区(-320 bp～0 bp)处于低甲基化状态。

2.3 小鼠PP1启动子区(-320 bp～0 bp)DNA甲基化位点分析

Methyl Primer Express software V1.0软件分析结果显示(图3)，在小鼠启动起始点上游320 bp，G+C含量高达70.25%，CpG含量为11.75%，符合CpG岛特征，是潜在的DNA甲基化位点。

图2 PCR2.1-小鼠PP1启动子区质粒Blast结果

图3 Methyl Primer Express software V1.0分析PP1启动子区

2.4 小鼠PP1启动子转录因子结合位点分析

启动子区转录因子结合位点预测发现，转录起始位点上游的320 bp 区域内含有大量的顺式调控元件，启动子附近可能结合的转录因子主要有: HSF、ADR1、MZF1等。其中以ADR1 的结合频率最高，含有18 个潜在结合位点。

3 讨 论

PP1在突出可塑性中有重要作用，突触可塑性被认为是学习记忆的主要的细胞基础。蛋白磷酸酶(PP)是神经递质释放的关键调节分子；PP1是哺乳动物大脑中通过调节染色体重塑的关键调节物[7]；PP1为转录依赖的学习记忆和突触可塑性的重要分子[2]，其功能可以抑制记忆。Miller等研究发现，情景恐惧训练1小时后，PP1基因的甲基化程度增加，而其mRNA表达出现降低，PP1的甲基化变化影响其表达，而PP1表达变化与记忆相关[5]。

本研究克隆了小鼠PP1基因启动子区起始密码上游320 bp 的片段，该区域富含G+C，G+C高达70%以上，同时CpG含量达到11%以上，软件分析其符合CpG岛特征。我们将该片段克隆到了PCR2.1载体上，该载体上有多克隆位点，容易将该片段亚克隆到pGL-3 basic中。在PP1起始密码上游320 bp范围内，有37个CpG二核苷酸，研究显示只有一个CpG二核苷酸被甲基化，表明常氧情况下该区段是处于低甲基化的。在该范围内有潜在的转录因子结合位点70个，其中ADR1的频率位点最多，达到了18个。SP1结合位点为8个，c-Myb结合位点为6个。我们克隆了该翻译起始点上游320 bp片段，并且分析了转录因子位点，为进一步通过定点删除来研究DNA甲基化在其转录中的作用奠定了基础。

我们先前研究低氧预适应可以提高小鼠学习记忆能力[8]，由于PP1调节是学习记忆的重要分子，其表达调控对于明确低氧预适应的脑保护有重要作用。本工作为进一步体外研究低氧预适应提高小鼠学习记忆能力奠定了基础。

[1] Ulke-Lemee A, Trinkle-Mulcahy L, Chaulk S, et al. The nuclear PP1 interacting protein ZAP3 (ZAP) is a putative nucleoside kinase that complexes with SAM68, CIA, NF110/45, and HNRNP-G[J]. Biochimica et biophysica acta,2007, 1774:1339-1350.

[2] Graff J, Koshibu K, Jouvenceau A, et al. Protein phosphatase 1-dependent transcriptional programs for long-term memory and plasticity[J]. Learning & memory (Cold Spring Harbor, NY),2010, 17:355-363.

[3] Haege S, Galetzka D, Zechner U, et al. Spatial learning and expression patterns of PP1 mRNA in mouse hippocampus[J]. Neuropsychobiology,2010, 61:188-196.

[4] Nomoto K, Shibata N, Kitamura K, et al. Molecular cloning and analysis of the 5'-flanking region of the rat PP1 alpha gene[J]. Biochimica et biophysica acta,1996, 1309:221-225.

[5] Miller CA, Sweatt JD. Covalent modification of DNA regulates memory formation[J]. Neuron,2007, 53:857-869.

[6] Wu Y, Wang H, Brautigan DL, et al. Activation of glycogen synthase in myocardium induced by intermittent hypoxia is much lower in fasted than in fed rats[J]. American journal of physiology,2007, 292:E469-475.

[7] Koshibu K, Graff J, Beullens M, et al. Protein phosphatase 1 regulates the histone code for long-term memory[J]. J Neurosci,2009, 29:13079-13089.

[8] Shao G, Zhang R, Wang ZL, et al. Hypoxic preconditioning improves spatial cognitive ability in mice[J]. Neuro-Signals,2006, 15:314-321.