品种混种方式对大豆胞囊线虫控制作用

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(1.中国科学院 东北地理与农业生态研究所 黑土区农业生态院重点实验室，海伦农田生态系统国家野外观测研究站， 黑龙江 哈尔滨 150081；2.大兴安岭地区农林科学院， 黑龙江 加格达奇 165000；3.黑龙江省农业科学院 大庆分院， 黑龙江 大庆 163316；4.黑龙江农垦九三管理局 植保植检站，黑龙江 嫩江 161441)

大豆是我国北方主要作物，以品质好而著称，但生产中大豆胞囊线虫(Soybean cyst nematode，SCN)病严重影响其产量[1]，该病也是全球大豆生产的重要病害[2]。多年来人们一直在不断地寻找最佳防治措施，由于大豆胞囊线虫以抗逆性较强的胞囊形式多年存活于土壤中，给防治带来极大的困难，最经济有效的控制方法为与禾本科作物轮作[3-4]以及应用抗病品种。由于大豆经济价值较高，长期轮作难以实现；抗病品种可以控制土壤中SCN胞囊数量，减轻SCN病害的发生，我国近年也审定了一些抗性较好的品种[5]，生产中应用面积在逐步扩大，但由于抗病品种在外观上和适应地区有一定局限性，大面积应用在近期还不容易做到。生产上如何发挥这些抗线虫品种的作用、有效地减少线虫危害是目前大豆生产中急需解决的问题。

利用作物品种遗传多样性可有效地控制植物病害，还可同时提高作物产量。作物种内多样性在病害控制上的应用包括多系品种和品种混合两种形式[6-7]。在水稻和小麦等作物上有许多成功的例子[8-10]。水稻上应用主要是采用抗感品种混栽控治水稻稻瘟病[11]。也有研究发现小麦品种混种可减少小麦白粉病、叶锈病和条锈病发病害，但对病害控制效果也因品种等因素存在差别[12]，如小麦条锈病防治效果的变化幅度在13 %～97 %[13]之间。以上研究都是利用品种多样性来控制空气传播的病害，但是应用于土传病害的研究鲜为报道。为了探讨利用品种多样性控制大豆胞囊线虫病的可能性，在北方大豆产区开展了利用抗大豆胞囊线虫品种与优质高产品种混合种植控制大豆胞囊线虫病研究，旨在探讨土传病害控制新途径。试验在黑龙江省中部的黑土区进行，采用北方抗大豆胞囊线虫病品种与当地生产中广泛应用的优质丰产品种黑农进行混种，探讨混种方式对大豆胞囊线虫病的控制作用以及对大豆生长发育和产量的影响。

2 材料与方法

2.1 试验地点及方法

试验地点在黑龙江省中部大豆主产区，位于海伦市中国科学院海伦农业生态试验站，中心地理位置为东经126°38′，北纬47°26′。茬口为15 a大豆连作和大豆迎茬(大豆-玉米-大豆)。大豆胞囊线虫自然发病区，土壤中大豆胞囊线虫经鉴定为3号生理小种，土壤类型为中厚黑土。

试验区随机排列，3次重复。小区长5 m，宽3.5 m，6垄。人工播种，3铲3趟。大豆施肥量：磷酸二铵150 kg· hm-2；K2SO4(K2O含量50%)75 kg·hm-2。种植密度30万株·hm-2。

2.2 大豆品种

2.2.1大豆胞囊线虫抗性品种。抗线4号(KX4)，由黑龙江省农业科学研究院大庆分院提供。

品种特性：亚有限结荚习性，株高70 cm左右，圆叶，白花，灰毛。圆粒，褐脐，百粒质量20 g～22 g，高抗大豆胞囊线虫3号生理小种，秆强，蛋白质含量38.20 %，脂肪20.77 %，生育日数113 d左右，平均产量2 300 kg·hm-2左右[14]，该品种适于黑龙江省和内蒙东部地区种植，耐盐碱和干旱[15]。

2.2.2大豆胞囊线虫非抗性品种。黑农35号(HN35)，由黑龙江省农业科学研究院大豆研究所提供。

品种特性：高蛋白品种，蛋白质含量45.24 %，脂肪含量18.36 %，亚有限结荚习性，植株高度为80 cm～85 cm，亚有限结荚习性，主茎发达，少分枝，白花，长叶，生育日数115 d左右。因其蛋白质含量高，丰产性好，是黑龙江省中部大豆主产区主栽品种[16]。

2.3 试验处理

抗性与非抗性品种混种方式。试验共设置6个处理，见表1，分别设置15 a大豆连作和大豆迎茬两不同茬口。

2.4 大豆植株根冠比测定

取样方法：大豆出苗后开始取样，每处理取大豆10株，3次重复，保持根系完整。每7 d取1次，共取6次。

大豆植株用清水冲洗掉根部残余土壤，自然晾干、称质量，计算大豆植株根冠比。

2.5 土壤中大豆胞囊线虫二龄幼虫测定

取样方法：大豆出苗后开始取样，去掉表土，拔出大豆根，取5 cm～20 cm耕层大豆根围土。每小区取样20个点，每点取约100 g，将所有土样混合，用四分法取500 g，放入新塑料袋中封好以保湿运回实验室，放在4 ℃冰箱中保存待用。每7 d取1次样，共取6次。

2.5.1大豆胞囊线虫二龄幼虫分离。大豆胞囊线虫二龄幼虫分离采用蔗糖浓度梯度离心法。取出冰箱中保存的土样，每份称取100 g置于250 ml烧杯中，加水150 ml浸泡1 h并转移到1 000 ml的塑料烧杯中，离心机1 750 rpm搅拌3 min，用强水流冲洗土样混浊液，静止30 s后过80目和500目套筛。收集500目筛上物于50 ml离心管中，2 000 rpm离心3 min，弃上清，再加入45 ml 615 g·L-1蔗糖溶液，充分混匀，500 rpm离心3 min，上清液过500目筛。用水轻轻冲洗筛上物，洗去残留的蔗糖，冲洗收集筛上线虫于50 ml离心管中定容到50 ml后放置于4 ℃冰箱中备用。

表1 抗性与非抗性品种混种方式Tab.1 Mixture treatments of resistant and non-resistant varieties

注：* 抗线4号和黑农35按种子数量比例1∶1混种种植；** 垄内不同单行分别种植抗线4号和黑农35。

2.5.2线虫计数。取出在冰箱内保存的线虫收集物，放置于振荡器上振匀。用移液管吸取5 ml放置于直径5 cm的培养皿内，在解剖镜下观察计数大豆胞囊线虫2龄幼虫数量，每处理3次重复。

2.6 土壤中线虫胞囊及卵计数

取样方法同2.5。

2.6.1土壤中线虫胞囊收集。土壤中线虫胞囊收集采用蔗糖浓度梯度离心法。取出冰箱中保存的土样，每份称取100 g置于250 ml烧杯中，加水150 ml浸泡1h并转移到1 000 ml的塑料烧杯中，离心机1 750 rpm搅拌3 min，用强水流冲洗土样混浊液，静止30 s后过20目和80目套筛。收集80目筛上物于50 ml离心管中，2 500 rpm离心3 min，弃上清，再加入45 ml 70 %蔗糖溶液，充分混匀，2 500 rpm离心3 min。上清液过60目筛，用水轻轻冲洗筛上物，洗去残留的蔗糖，冲洗到放有滤纸的漏斗中，过滤后取出滤纸，收集胞囊。

2.6.2胞囊计数。解剖镜下观察挑取的胞囊，并记录数量。

2.6.3线虫卵密度测定。取出冰箱中保存的土样，每份称取100 g置于250 ml烧杯中，加水150 ml浸泡1h，用湿筛法将土壤样品中的胞囊筛出，经橡胶塞在200目筛上研磨后，收集200目和500目筛上物于50 ml离心管中，35 %蔗糖溶液梯度2 500 rpm离心3 min，含卵的上清液再过500目筛，清水冲洗后，收集于50 ml离心管中定容为50 ml，将卵悬液保存在4 ℃冰箱中，用以测定大豆胞囊线虫的卵密度。测定时向塑料小皿(直径为35 mm)加入1 ml卵悬液，放置于显微镜下观察，记录卵数量，3次重复，计算卵密度。

2.7 测产考种

各小区内取2 m2用于测产量，连续取10株用于考种。考种项目有：株数·m-2、株高、结荚高度、节数、分枝数、单株荚数、有效荚数、单株粒数、单株粒质量、虫食率、病粒率等。

2.8 数据分析

试验结果的方差分析均采用SAS 6.0版本。

3 结果与分析

3.1 品种混种方式对大豆胞囊线虫控制作用

3.1.1不同混种方式土壤中大豆胞囊线虫二龄幼虫变化。在我国北方大豆主产区，胞囊线虫第一代对生产威胁很大，因此，控制技术对大豆胞囊线虫第一代的控制效果非常重要。测定土壤中的大豆胞囊线虫二龄幼虫(J2)数量，可以在一定程度上明确不同混种方式中病害侵染源的动态变化。

图1 15年大豆连作田土壤中SCN 二龄幼虫动态变化Fig.1 The fluctuation of SCN juvenile in 15-year soybean continuous cropping field

在15 a大豆长期连作区，见图1，所有6个处理的土壤中胞囊线虫2龄幼虫数量在调查期内总体变化趋势相近，即随着大豆生育进程，在出苗后逐步增加，在大豆出苗后7 d始见二龄幼虫(J2)，14 d开始显著增加，21 d时达到高峰后逐渐下降。6个处理的土壤中胞囊线虫2龄幼虫数量总体比较，在21 d后黑农35清种最高，达到82.4条·(100 ml土壤)-1；抗线4号最低，其它的2个品种间种和混种的4个处理居中，在这些间种和混种方式中以黑农35和抗线4号1∶1混合种植胞囊线虫2龄幼虫数量为低。在14 d时抗性品种抗线4号根际土壤内线虫数量最高，达到39.6条·(100 ml土壤)-1，并且与黑农35净种和1∶1混种处理间差异显著。该处理的高峰早于其它处理，其原因可能由于抗线虫品种根系分泌物对线虫卵孵化的刺激要早于非抗线品种或抗线4号根系分泌物对大豆胞囊线虫卵孵化较非抗线虫品种有更强促进作用所致[17]。出苗28 d后所有处理土壤内J2数量显著下降，并且持续减少。可能是土壤中有活性的卵已经基本完成孵化，孵化后的J2已经侵入大豆根部或者未能找到寄主而在土壤中死亡。所有处理的土壤中J2数量在出苗后35 d和42 d时达到最低点。在整个过程中，1∶1混种减少了土壤中J2数量，仅高于抗线4号。

大豆迎茬地块土壤中大豆胞囊线虫2龄幼虫数量总趋势与15 a大豆连作接近图2，整体J2数量上要高于15 a大豆连作区。土壤内线虫数量在出苗后14 d开始显著增加，抗线4号根际土壤内J2数量最高，达到70.3条·(100 ml土壤)-1，并且与黑农35以及1∶1混种处理间差异显著。其它处理则在出苗后21 d时土壤中J2数量达到最大值，以黑农35清种数量最高，显著高于各混种处理，混种方式间差异不显著。而抗线4号的根周围土壤内的J2数量在21 d后开始下降，低于其它各处理水平。所有处理在出苗28 d后土壤内J2数量明显下降，到出苗35 d和42 d时达到最低点。各混种处理对大豆胞囊线虫2龄幼虫的控制效果接近抗性品种清种。

3.1.2不同混种方式大豆根表雌虫数量变化。大豆胞囊线虫雌虫在发育成熟后体壁加厚发育为胞囊，附着在大豆根表，而后落入土壤中，胞囊中的卵在周围环境适合时孵化为幼虫侵入寄主根内，形成再次侵染循环。因此，根表面的雌虫数量可以在一定程度上表明线虫繁殖能力的强弱，雌虫的多少直接影响到下一个世代线虫的再侵染能力。

15 a大豆连作田中6个处理均为出苗后28 d时在大豆根部始见雌虫，见图3。出苗后35 d雌虫数量达到高峰，其中以黑农35清种数量最多，平均每株大豆根上达到了22.3个，显著高于其它各混种处理，抗线4号最低，仅为1.5个每株。1∶1混种方式低于抗线4号清种外所有的其它混种方式，各混种方式之间存在一定差异，但差异不显著。出苗后42 d，所有处理根表面雌虫数量开始减少，此时胞囊已经成熟，脱落到土壤当中。仍是以黑农35号的根表面的雌虫数量最高，相当于其它处理根表雌虫数量的1倍以上。所有混种方式中以1∶1混种处理效果最好，大豆根表雌虫数量要显著低于黑农35。

图2 1年大豆连作田土壤中SCN 二龄幼虫动态变化Fig.2 The fluctuation of SCN juvenile in corn-soybean continuous cropping field

图3 15年大豆连作田大豆根表SCN雌虫动态变化Fig.3 The fluctuation of SCN Female on soybean root in 15-year soybean continuous cropping field

图4 1年大豆田大豆根表SCN雌虫动态变化Fig.4 The fluctuation of SCN Female on soybean root in corn-soybean continuous cropping field

1 a大豆迎茬田大豆根部雌虫数量与15 a大豆连作总体趋势相同，见图4。所有处理在出苗后28 d时在大豆根部始见雌虫，出苗后35 d雌虫数量达到最高峰，其中以黑农35数量最高，相当于各混种方式的2～4倍，抗线4号最低，1∶1混种方式低于除抗线4号净种外所有的混种方式，混种方式之间存在一定差异，但差异不显著。出苗后42 d，所有处理根表面雌虫数量减少。其中以黑农35号的根表面的雌虫数量最高，为12.1个每株，1∶1混种处理的根表雌虫数量接近抗线4号净种，平均仅为2.6个每株，显著低于其它混种处理以及黑农35清种。1∶1混种处理在所有混种方式中效果最好，接近抗线4号清种。

3.2 不同混种方式大豆根冠比变化

大豆胞囊线虫侵染大豆后对大豆根部生物量的影响要大于对地上部的影响，因此也会引起大豆根冠比的变化，通过测定大豆的根冠比可以在一定程度上反映种植方式对大豆植株生长的影响。

15 a大豆连作田中所有处理大豆根冠比随出苗天数增加而不断降低，见图5，在出苗28 d后趋于平稳。出苗7 d时黑农35的根冠比最高，显著高于其它各处理，抗线4号的根冠比最低，可能是由于品种间差异引起。出苗14 d后由于大豆胞囊线虫的侵入，非抗性品种的根冠比要低于抗性品种，而1∶1混合种植的根冠比最高，大于两个清种处理，并存在显著性差异。出苗21 d起，由于大豆植株的快速生长，使得各处理的根冠比相对于14 d时均发生大幅度降低，但是1∶1混合种植的根冠比仍然明显高于所有清种处理。并且这一趋势一直保持到出苗后42 d。因此，1∶1混合种植处理对大豆胞囊线虫病害发生有较好的控制作用，减轻了线虫对大豆根部的危害。

图5 15年大豆连作田大豆根冠比动态变化Fig.5 The ratio of soybean root to shoot in 15-year soybean continuous cropping field

迎茬田大豆根冠比总体要高于15 a大豆连作，并且整体趋势相同，见图6，随出苗天数增加而不断降低，在出苗28 d后趋于平稳。出苗7 d时，黑农35清种的根冠比最高，并显著高于抗线4号，与各混种处理之间存在差异但不显著。出苗14 d后黑农35的根冠比要低于抗线4号，而1∶1混合种植的根冠比最高，显著高于黑农35清种。出苗21 d开始，由于大豆植株的快速生长，使得各处理的根冠比相对于14 d时均发生大幅度降低，但是1∶1混合种植的根冠比仍然明显高于清种处理。28 d后，各处理之间虽存在一定差异，但差异不显著。

图6 1年大豆连作田大豆根冠比动态变化Fig.6 The ratio of soybean root to shoot in corn-soybean continuous cropping field

3.3 不同混种方式对大豆产量影响

控制大豆胞囊线虫病害发生的目的是减轻病害对大豆植株正常生长发育的影响，提高大豆产量，大豆的产量是评价不同混种方式之间是否存在差异的最重要因素之一。

在大豆成熟后对其测产，见表2，结果表明，大豆迎茬田中，以两品种1∶1混合种植处理的产量最高，双垄间隔种植产量最低。黑农35的产量要低于抗线4号，可能由于大豆胞囊线虫病害的影响。1∶1混种较黑农35号清种增产8.8 %，差异显著，但与抗线4号差异不显著，较其增产2.8 %。15 a连作与迎茬相比总体产量较低，大豆产量以1∶1混合最高，单垄间隔种植最低， 1∶1混种较黑农35号清种增产8.2 %，差异显著，较抗线4号清种增产7.4 %，但无显著性差异。无论在15 a连作还是迎茬条件下单垄和双垄间隔种植产量都不高，明显不如混合种植。品种搭配以1∶1混合种植增产效果明显。

表2 大豆迎茬和15年连作田不同混种方式大豆产量Tab.2 Soybean yield under different mixture cultivar model in corn-soybean and 15-year soybean continuous cropping fields

3.4 混种方式对后茬大豆胞囊线虫侵染源影响

大豆胞囊线虫是土传性病害，病原物以胞囊的形式在土壤中越冬，在第二年春季胞囊中的卵孵化后对春播大豆进行侵染，引起病害发生[18]。控制大豆胞囊线虫在秋季收获时的种群数量就可以有效的降低第二年病害发生的侵染来源，使病害发生得到持续的控制，因此收获后土壤中线虫卵的数量致关重要。

大豆收获后对土壤中线虫卵数量调查见表3。大豆迎茬田中，种植黑农35后线虫种群数量明显著增加，相当于播前数量的3倍左右。抗线4号清种处理线虫种群数量降低，低于播种前水平，卵数量相当于播种前水平的20 %。各混种方式线虫种群数量较播种前均有所降低，但差异不显著。以1∶1混种植降低最多，相对于播前减少了30 %，强于其它混种方式，对大豆胞囊线虫后茬侵染源具有较强的控制作用。15 a大豆连作田中收获后土壤中大豆胞囊线虫卵数量总体上要低于大豆迎茬田，分析原因可能是大豆长期连作后土壤中产生了抑制大豆胞囊线虫的天敌，如真菌[19]。黑农35清种在收获后线虫数量明显增加，与播种前相比差异显著，是播前的3倍以上。抗线4号线虫数量明显降低，与播种前差异显著，卵数量减少到播前的30 %以内。各混种方式大豆胞囊线虫的种群数量较播种前有所降低，其中按1∶1混种种植的卵数量与播前差异显著，降低到了播前水平的50 %。其它混种方式均有所降低，但未达到显著差异水平。1∶1混种对线虫的控制作用15 a连作田效果要好于迎茬地块，在所有混种方式中效果最好。

表3 迎茬和15年大豆中不同混种方式收获后土壤中SCN卵数量Tab.3 The eggs of SCN under different mixture cultivar models in 2-year and 15-year soybean continuous fields after harvest time

4 讨 论

通过抗性和非抗性线虫品种清种、不同间隔方式和混合等种植方式比较，对大豆胞囊线虫发病情况的调查以及对大豆产量的测定，明确了利用抗性品种与非抗性品种进行种子混合种植为最佳的方式，对大豆胞囊线虫病害发生的控制能力以及增产效果均要优于成行间隔种植和清种。

利用生物的遗传多样性控制植物病害，是应用了种植管理和抗病品种等多种方法的综合控制措施，目前生产上主要是应用于控制水稻稻瘟病以及小麦锈病等空气传播的病害，取得了较好的防治效果[20]。气传病害的特点是病原微生物随空气的流动而在田间扩散传播，从而引起病害的暴发流行。因此在利用作物的遗传多样性控制此类病害发生时，所采用的种植方式多为将抗性品种与非抗性品种成行的间隔种植[21]。其主要原因可能是在非抗性品种中间隔种植抗性品种可以形成有效的病原微生物阻隔带，使其难以在田间顺利地随气流传播，达到控制病害蔓延流行的目的。而且在大多数情况下，非抗性品种的品质较好经济价值高，成行间隔种植有利于与抗性品种分开收获。水稻种植一般为旱地育苗后在水田内插秧，成行种植有利于机械耕作，节约劳动成本[22]。

大豆胞囊线虫病为土壤传播病害，发病田中的病原生物在大豆种植前已经存在于土壤中，而且大豆胞囊线虫自身虽然可以在土壤中运动迁移，但是运动距离十分有限，一般水平距离在1 m之内，垂直距离在30 cm之内。对利用作物遗传多样性控制土壤传播病害的种植方式进行了研究，结果表明，将抗性品种与非抗性品种进行单垄或双垄的成行间隔种植并不能取得很好的控制胞囊线虫病效果，可能是胞囊线虫无法凭借自身运动进行垄与垄之间的移动传播。而对于在同垄内不同单行中分别种植抗性品种和非抗性品种，可能是由于抗胞囊线虫品种和非抗线虫品种种植不如1∶1混合种植均匀，非抗性品种土壤中胞囊线虫仍然可以像清种一样正常繁殖，胞囊线虫在第二代时可以沿着非抗性品种种植单行的一侧进行二次侵染。在将抗性品种与非抗性品种种子混合后种植的处理中，由于种子是完全混合后播种，抗性品种可以在非抗性品种之间随机形成有效的抗性阻隔带，使胞囊线虫无法凭借自身运动在垄内自由移动，降低了病害的传播速度，并且有效地控制了第二代线虫对非抗性品种的再侵染程度。由于在大豆生产上多为大型机械直接播种，种子混合处理与成行间隔相比更加简便易行，节约生产成本由此看来在大豆迎茬和15 a连作地按1∶1种子混种，控制线虫和产量结果均要明显优于其它种植方式。

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