电气石/水凝胶复合材料体外细胞相容性评价

李小玉,赵 凯,肖建刚,李峻峰

(1.四川大学华西口腔医院口腔疾病研究国家重点实验室,四川成都 610041; 2.四川大学材料科学与工程学院,四川成都 610065; 3.成都理工大学材料科学技术研究所,四川成都 610059)

0 引 言

电气石是以含硼为主的环状硅酸盐矿物,其化学式为,Na(Mg,Fe,Mn,Li,Al)3Al6[Si6O18](BO3)3(OH,F)4,属三方晶系.通常,天然电气石的复杂化学成分和晶体结构使电气石具有自发极化、红外辐射、释放负离子等特性[1].有研究发现,电气石微粉对水分子团簇结构的改善有明显作用,能够使水分子团簇中的氢键稳定性下降,并影响离子的转移,从而促进电离,降低缔合度,使水形成小分子团[2].一般认为,水分子团愈小,水的活性愈高,可使水分子透入细胞膜的数量和速度大为增加,利于细胞的生长增殖.近期的相关研究表明,电气石能消除过剩自由基,活化组织细胞,并通过促进细胞增殖显著地促进细胞的生长和生物量的增加[3-4].

目前,科研人员对于电气石的基本性质与相关理论研究已日趋深入,但对其在生物医用领域,尤其是在人体组织修复方面的应用尚未见报道.本研究将电气石复合到水凝胶中,分析电气石对人成骨肉瘤MG63细胞生长增殖的影响,为电气石在组织修复新材料方面的应用提供基础实验数据.

1 实验方法

1.1 材料制备与表征

在烧杯中加入一定质量的水凝胶、电气石粉体和辅料,再加入蒸馏水,并用电动搅拌器混合均匀,室温下注入凝固液制成电气石/水凝胶复合材料.电气石与水凝胶的质量比分别为,1∶20、1∶10、1∶5、1∶2.复合材料用去离子水冲洗后备用.

在倒置显微镜(TE2000-U,Nikon)下观察复合材料的形态并照相.磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)冲洗复合材料3次,戊二醛固定 3h, 30%、50%、75%、80%、95%、100%梯度乙醇脱水,15 min/次,乙酸异戊酯替换30 min,临界点干燥后用扫描电子显微镜(JSM-5600LV,JEOL)观察复合材料形貌并照相.

1.2 细胞培养

实验所用人成骨肉瘤MG63细胞由四川大学华西口腔医院提供.

将冷冻细胞置于37℃恒温水浴中快速融化, 1 000 rpm离心8 min(LD4-2型离心机,江阴市科研器械厂),加入含10%小牛血清(G ibco Inc.)的F12培养基(Invitrogen Inc.)培养(100 U/mL青霉素及100 μg/mL链霉素),次日换液.待细胞贴满瓶壁后,用胰酶(Sigma Inc.)消化,吹打制成细胞悬液,分瓶后继续培养.

将电气石/水凝胶复合材料(1 cm×2 mm)用蒸馏水超声清洗3次,干燥后,置于24孔板(Corning Inc.)中,紫外灭菌,加入含10%小牛血清的F12培养基浸泡过夜.

吸弃原有培养基,取人成骨肉瘤MG63细胞,用胰酶消化,吹打制成细胞悬液,按照2×104个/mL的密度接种细胞,每孔接种1 mL,使细胞自然沉降在材料表面,隔天更换新鲜培养基.另外,不放置材料的孔作为空白对照.

1.3 细胞相容性检测

在培养第4 d,用倒置显微镜观察共培养的人成骨肉瘤MG63细胞的形态并照相.吸弃原有培养基, PBS吹洗3次.避光条件下,按照Live&Dead Cells试剂盒(Molecular Probes Inc.)说明配制荧光染色工作液,每孔加入荧光染色工作液100μL,放于37℃、5%CO2的培养箱中避光孵育30 min,PBS吹洗,倒置荧光显微镜下观察并拍照.电气石与细胞共培养4 d、10 d、15 d时各取一板细胞,吸弃原有培养基,加入1 mL新鲜F12培养基,每孔加入40μL 5 mg/mL的MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,Sigma Inc.),放于培养箱中孵育3.5 h后,吸弃液体,加入450μL二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO),振摇 5 min,放于培养箱孵育 30 min,振摇5 min,取150μL反应液转移到96孔板中,用酶联免疫检测仪(PerkinElmer wallac 1420)在波长490 nm处测定其光吸收值.

2 结果与讨论

2.1 材料形貌

对实验制备的3号样品用光镜及电子扫描显微镜观察其形貌,结果如图1所示.

图1 3号复合样品光镜与电子扫描显微镜照片形貌

图1(a)为电气石粉末复合到水凝胶中的光镜照片,由图可见电气石呈大小不一的片状,不均匀地分散在水凝胶中.图1(b)为电子扫描显微镜照片,从材料的表面可看到电气石的块状突起,粒径在100μm以下,密度较大,说明其分散状况良好.

2.2 细胞形态

人成骨肉瘤MG63细胞与复合材料共培养4 d后的细胞形态如图2所示.

图2 MG63细胞与复合材料共培养4 d的细胞形态

由图2可见,培养4 d后,培养板内细胞形态多为梭形或多边形贴壁生长,胞质、胞仁明显,生长状态良好,细胞无衰老及异常分裂现象.其中:1号培养板上(图2(b))细胞分散状况好,生长良好;2号培养板上(图2(c))细胞团聚生长,有少量悬浮死亡的细胞;3号培养板上图(2(d))细胞团聚,生长良好;4号培养板上(图2(e))细胞生长较分散,成单层生长,伸出较多伪足.细胞形态分析显示,人成骨肉瘤MG63细胞与不同比例的复合材料共培养均能够正常生长,不影响细胞形态及增殖,此表明复合材料具有良好的细胞相容性及表面活性,对细胞无明显毒副作用.

2.3 细胞活性

Calcein-AM和碘化丙啶(Propidium iodide,PI)溶液可分别对活细胞和死细胞进行染色.Calcein-AM可透过细胞膜,通过活细胞内的酯酶作用,脱去AM基,产生的钙黄绿素(Calcein)能发出强绿色荧光,其仅对活细胞染色.而作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜,却能够嵌入死细胞的DNA双螺旋而产生红色荧光,其仅对死细胞染色.由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm波光荧光激发,因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞.人成骨肉瘤MG63细胞与复合材料共培养4 d的荧光染色照片如图3所示.

图3 MG63细胞与复合材料共培养4 d荧光染色照片

从图3可以看出,人成骨肉瘤MG63细胞与复合材料共培养4 d后,细胞成片生长,呈单层铺展,形态正常,为三角形或多边形,生长及增殖状况良好,死亡细胞少.其中:1号培养板上(图3(b))细胞大小不一,密集处细胞体积小;2号培养板上(图3(c))细胞体积差别小;3号培养板上(图3(d))细胞较其他组稀疏,伪足长,死亡细胞较集中;4号培养板上(图3(e))细胞较密集,细胞体积差别大.荧光形态分析显示,人成骨肉瘤MG63细胞能够伸出伪足与复合材料良好地粘附,形态良好,密度大,死亡少,表明复合材料具有良好的细胞相容性及表面活性,对细胞无明显毒副作用,细胞能够正常生长及增殖.

2.4 细胞增殖

MTT比色法[5]是一种检测细胞存活和增殖性的有效的方法,其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫结晶物,并沉积在细胞中,而死细胞无此功能.人成骨肉瘤MG63细胞与复合材料共培养4 d后,粘附在培养板上的细胞增殖情况如图4所示.

从图4可见,人成骨肉瘤MG63细胞与复合材料共培养4 d后,实验组的数值高于对照组,各组间无显著性差异(p>0.05);到第10 d,吸收值达到高峰,对照组增殖迅速(p<0.01),明显高于实验组,实验组之间没有显著性差异(p>0.05);到第15 d,各组吸光值均下降,各组不存在显著性差异(p> 0.05).后期对照组明显比实验组增殖快,这是由于实验组可供粘附的板面积比空白组小,并且部分细胞粘附到了材料上,使生长在板上的细胞数量减少,从而导致后期对照组的比色值高于各实验组.随后,由于细胞间接触抑制使得少量细胞脱落,各组值下降.实验表明,复合材料对于细胞有一定的亲和力,细胞能够粘附生长,无明显毒副作用.

图4 MG63细胞与不同比例复合材料共培养在板上的增殖情况

3 结 论

通过本研究发现,人成骨肉瘤MG63细胞与电气石/水凝胶复合材料共培养不影响细胞正常的生长及增殖,细胞形态良好,细胞结构明显,大小及密度适中,无异常分裂现象,死亡细胞少,表明电气石/水凝胶复合材料具有良好的细胞形容性,无明显毒副作用,可以用作组织构建.本研究证实,电气石与水凝胶复合后不仅保留了电气石的优良特性,也具有良好的生物相容性,此为其在生物材料方面的应用提供了一种新思路.

[1]王光华,董发勤.电气石的功能属性及应用[J].中国非金属矿工业导刊,2007,28(5):9-11.

[2]夏枚生,胡彩虹,张红梅,等.电气石处理水对Caco-2细胞生长和碱性磷酸酶活性的影响[J].细胞生物学杂志, 2005,27(3):358-362.

[3]骆靖中.电气石的特性及其在健康与环保领域的新用途[J].中国非金属矿工业导刊,2007,28(6):17-19.

[4]黄城贵,潘丽萍,李海航,等.电气石对绿豆培养细胞生长的影响[J].生物技术,2008,18(3):61-63.

[5]赵嘉惠,张华屏,王春芳.MTT法在检测细胞增殖方面的探讨[J].山西医科大学学报,2007,38(3):262-263.