山楂酸、科罗索酸及其衍生物抑制HL-60细胞增殖和诱导其分化的研究

柳 军 于东升 尚 靖 孙宏斌 张陆勇

五环三萜化合物广泛分布于自然界中，其生物活性和药理活性丰富多样，如抗炎、保肝、抗艾滋病、抗癌、抗糖尿病、降血脂、抗动脉粥样硬化和免疫调节等作用[1]。我们之前曾报道过山楂酸及其相关的五环三萜有降糖和降脂功效[2]。为了探讨五环三萜在治疗白血病方面的作用，我们研究了五环三萜对人早幼粒白血病细胞HL-60的作用。

科罗索酸和山楂酸是天然五环三萜化合物。山楂酸富集于橄榄皮中，2α，3β-二乙酰氧基熊果-12-烯-28-酸，2α-乙酰氧基-3β-羟基熊果-12-烯-28酸均是科罗索酸的衍生物[3]。我们主要考察山楂酸、科罗索酸、2，3-二乙酰氧基科罗索酸和2-乙酰氧基科罗索酸对HL-60细胞的生长抑制作用和促进其分化诱导的作用。

1 材料与方法

1.1 化合物与试剂

山楂酸(化合物1)、科罗索酸(化合物2)、2，3-二乙酰氧基科罗索酸(化合物3)和2-乙酰氧基科罗索酸(化合物4)由中国药科大学新药研究中心提供，纯度>95%。全反式维甲酸(ATRA)、NBT购自Sigma公司，RPMI 1640培养购自Gibco Life Technologies公司，胎牛血清购自杭州四季青生物公司(Hangzhou Sijiqing Bio-material Co.，Ltd.，China)，LDH试剂盒购自南京建成生物公司。

1.2 细胞培养

人早幼粒白血病细胞HL-60培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的RPMI 1640培养基中，置37℃、5% CO2培养箱中培养。2～3天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。将HL-60细胞悬液调整为1×105个/mL，接种于96孔培养板。化合物溶于DMSO，用RPMI培养基稀释，使最终加入培养基中的DMSO浓度低于0.1%。

1.3 四氮唑蓝比色(MTT)法

将人早幼粒白血病细胞HL-60悬液调整为1×105个/mL，接种于96孔培养板，每孔180 μL，实验组分别加入4种不同浓度的化合物，每组3个复孔，37℃、5% CO2培养箱中培养，3天后各孔加入MTT 20 μL，继续培养4 h，测定其在570 nm下的吸光度。

化合物对细胞毒性作用采用LDH试剂盒检测，严格按照试剂盒说明检测细胞释放LDH的含量。

1.4 硝基四氮唑蓝还原试验法

细胞诱导分化的检测采用改良的硝基四氮唑蓝还原(NBT)试验法[4]。细胞在96孔板中培养4天，然后重旋于含2 mg/mL NBT的RPMI 1640培养基中。37℃孵育30 min，570 nm处测定吸光度。

1.5 统计学处理

统计学分析采用SPSS统计软件，计量资料以mean ± SD表示，组间均值采用t检验(n=3)，平均值与对照组采用重复测量的方差分析(ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 山楂酸、科罗索酸及其衍生物对HL-60细胞增殖的影响

HL-60细胞以1×105个/mL的密度接种于96孔板中，然后加入不同浓度的化合物，72 h后，MTT法检测细胞增殖活性。结果表明，化合物山楂酸、科罗索酸、2，3-二乙酰氧基科罗索酸和2-乙酰氧基科罗索酸对HL-60细胞具有生长抑制作用，并呈剂量依赖关系(图1)。

图1 MTT法检测山楂酸、科罗索酸及其衍生物对HL-60细胞增殖活性的影响

2.2 山楂酸、科罗索酸及其衍生物对HL-60细胞LDH含量的影响

山楂酸(1 μM)、科罗索酸(1 μM)、2，3-二乙酰氧基科罗索酸(1 μM)和2-乙酰氧基科罗索酸(1 μM)，ATRT(1 μM)和DMSO(1 μM)刺激HL-60细胞72 h后，检测培养基中LDH含量。结果表明，化合物对LDH的漏出率无显著影响(图2)。

2.3 山楂酸、科罗索酸及其衍生物诱导HL-60细胞NBT还原活性的作用

HL-60细胞加入山楂酸(1 μM)、科罗索酸(1 μM)、2，3-二乙酰氧基科罗索酸(1μM)和2-乙酰氧基科罗索酸(1 μM)和ATRT(1 μM)刺激72 h，然后检测HL-60细胞中NBT阳性细胞率。实验结果表明，山楂酸、科罗索酸及其衍生物，可以增高HL-60细胞NBT阳性细胞率,其他组与对照组比较,P均<0.01(图3)。

图2 山楂酸、科罗索酸及其衍生物对HL-60细胞LDH含量的影响

图3 山楂酸、科罗索酸及其衍生物对HL-60细胞NBT阳性细胞率的影响

3 讨论

目前恶性肿瘤仍居城市人口死因的首位，癌症的治疗仍然是一个挑战。虽然五环三萜治疗和预防癌症的作用已有广泛的研究和报道，但其影响肿瘤细胞分化诱导作用的报道并不多[5～7]。为了研究五环三萜对肿瘤细胞分化诱导的影响，本文采用山楂酸、科罗索酸及其2个衍生物，研究这4个五环三萜化合物对HL-60细胞的生长抑制作用和促进细胞分化诱导的作用。HL-60细胞从急性骨髓性白血病患者获得，可以分化为单核细胞或巨噬细胞[8,9]，广泛用于研究正常细胞与白血病细胞有关增殖与分化。

本实验结果表明，当HL-60细胞分别用0.0001、0.001、0.01和0.1mmol/L的山楂酸、科罗索酸、2，3-二乙酰氧基科罗索酸、2-乙酰氧基科罗索酸处理后，细胞生长呈剂量依赖性抑制。我们通过测定NBT还原活性来检测其诱导HL-60细胞分化能力，结果表明山楂酸、科罗索酸、2，3-二乙酰氧基科罗索酸、2-乙酰氧基科罗索酸在1μM时，诱导NBT阳性细胞率分别为26.1%、17.2%、22.6% 和 39.6%。其中2-乙酰氧基科罗索酸诱导NBT减少的能力最强，与阳性对照化合物维甲酸NBT阳性细胞的百分数相近。

五环三萜类化合物在植物界中的分布极为广泛，是许多中草药的主要有限成分。在抗肿瘤药物的筛选中获得了不少有活性的化合物。本实验结果表明，山楂酸、科罗索酸、2，3-二乙酰氧基科罗索酸及2-乙酰氧基科罗索酸，对HL-60细胞具有抑制其增殖作用并且具有诱导其分化作用，其中2-乙酰氧基科罗索酸诱导粒细胞性分化能力最强。对更多的五环三萜化合物进行结构改造、修饰及生物学评价，可能会发现更有潜力的低毒抗癌化合物。

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