三江平原大豆根系和水稻根系土壤细菌的分离与鉴定*

吴道秦，王继华，刘淑丽，牛 佳，陈定华

(哈尔滨师范大学)

三江平原大豆根系和水稻根系土壤细菌的分离与鉴定*

吴道秦，王继华＊＊，刘淑丽，牛 佳，陈定华

(哈尔滨师范大学)

大豆根系和水稻根系土壤的微生物类群中，细菌数量最多，放线菌数量次之，真菌数量最少，且根系土壤微生物总数明显高于根外土壤微生物总数.对三江平原大豆根系和水稻根系土壤中的细菌进行分离，根据细菌个体特征、菌落形态特征及其生理生化特性进行初步鉴定.结果表明，大豆根系土壤中主要分布着芽孢杆菌属、黄单胞菌属、气单胞菌属、甲基单胞菌属、假单胞菌属、根瘤菌属6个菌属;水稻根系土壤中分布着微球菌属、黄杆菌属、根瘤菌属、奈瑟氏球菌属、葡萄球菌属5个菌属.同时，探讨了土壤部分理化性质对大豆和水稻根系细菌数量的影响，明确了根系细菌数量与土壤含水量、有机质含量、pH等有一定的相关性，对今后大豆和水稻田间施肥，提高粮食产量具有一定的指导意义.

大豆根系;水稻根系;土壤;细菌;分离;鉴定

0 引言

三江平原是东北平原组成部分之一，又称三江低地，是世界三大湿地之一，湿地面积大约有7200多公顷，是我国最大的湿地分布地区，又是亚洲及我国重点保护湿地之一［1］.三江平原土地肥沃，大多数土壤的有机质和养分总储量甚高，有较高的肥力，是黑龙江省重要的粮食生产基地，是大豆、水稻、小麦等重要商品粮生产基地.其中大豆和水稻作为主要粮食作物，其产量和生产对三江平原的粮食经济生产起着关键性的作用.微生物在大豆根系和水稻根系土壤营养元素循环过程中起着十分关键的作用，而细菌在大豆根系和水稻根系的土壤中分布最广泛，细菌通过其自身的生理特性可引起土壤成分变化，调节土壤酸碱性等，为农作物的生长提供营养［2］.该文主要研究大豆根系和水稻根系土壤细菌的种类和生理生化特性，认识土壤微生物结构，能够更好地发挥土壤微生物的功能，为改良土壤，提高大豆和水稻的产量提供科学依据，为工农业生产服务［3］.因此研究三江土壤微生物结构的变化及与粮食产地生态环境之间的关系具有重要的科研和实践意义.

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 样品来源

土壤取自于中国科学院三江平原沼泽湿地生态实验站实验场，地理位置为 47°35'N，133°31'E，取样时间分别为2007年秋季收获之后和2008年春季耕作之前.在划定采样范围后，根据采样范围内地块面积的大小、土壤水分、肥力情况、地块形状等特征，以“五点法”均匀分布采样点，定量采集0～20 cm深度的大豆根系(DD)和水稻根系(SD)土壤样品，装入无菌聚乙烯袋后密封，土壤带回实验室立即进行土壤微生物分离［4］.

1.1.2 实验器材

灭菌的聚乙烯袋、灭菌土铲、摇床、冰箱、高压灭菌锅、培养箱、振荡培养箱、显微镜、电子分析天平、烘干箱、无菌操作台、电炉、培养皿、锥形瓶等.

1.1.3 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠 5 g，琼脂 15 ～20 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7.0 ～7.2，121℃灭菌20 min.

1.2 实验方法

1.2.1 土壤菌悬液的制备

准确称取土壤样品10 g，置于灭菌的盛有90 mL无菌水且带有玻璃珠的三角烧瓶中，放在摇床中振荡约30 min，使土样和水充分混合将细菌细胞分散开.用灭菌的移液管吸取菌悬液1 mL加入到有9 mL无菌水的试管中，配置成10－1浓度的菌液，同理在无菌操作台用倍比稀释法依次稀释，使菌液浓度依次为 10－2、10－3、10－4、10－5、10－6［5］.

1.2.2 土壤细菌数量的统计

采用平板涂布法进行，菌群数量单位为cfu/g干土.用无菌吸管吸取适量10－4、10－5、10－63个浓度的土壤悬液，分别滴加于牛肉膏蛋白胨培养基表面，然后用灭菌的涂布棒将土壤悬液均匀地涂布于培养基表面，直至土壤悬液完全干燥，每个浓度设3个平行重复，倒置于恒温箱内培养.培养2～4 d后，选取菌落数为20～200个的培养皿进行观察并计数.

每克干土中菌数=(菌落平均数×稀释倍数×20)∕干土百分率

1.3.3 菌种的分离与纯化

用接种环以无菌操作从涂布后的培养基表面上分别挑取不同形态的单菌落，接种于新培养基平板上，进行四区划线或一区划线，不断重复上述操作过程，直至培养基表面出现单一菌落，且表型特征稳定，即得到纯菌.

1.3.4 细菌形态学观察

细菌菌落形态特征观察:主要观察表面菌落的形状、大小、颜色、粘稠度、透明度、边缘情况及隆起情况、光泽、质地、表面性质等［6］.

细菌个体形态特征观察:将获取的单一菌株在高倍镜及油镜下分别进行个体形态、大小及排列情况、革兰氏染色反应［7］.

1.3.5 细菌生理生化指标测定

将分离纯化所得到的优势菌种进行淀粉水解实验［8］、糖发酵实验(葡萄糖、乳糖、蔗糖)、甲基红实验、V.P 实验、柠檬酸盐实验［9］、接触酶实验、吲哚实验、硝酸盐还原实验和氧化酶实验［10］.

1.3.6 细菌菌种鉴定

依据经典的微生物分类方法［11］进行分类，主要依据细菌种的形态学特征和生理生化特征，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)和相关文献进行初步鉴定［12－16］.

1.3.7 土壤理化性质的测定

土壤有机质含量、含氮量、pH、含水量的测定.

2 结果与分析

利用细菌纯培养技术从大豆根系土壤中共分离得到7株细菌，分别编号为DD1、DD2、DD3、DD4、DD5、DD6、DD7;从水稻根系土壤中共分离得到9 株细菌，分别编号为 SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6、SD7、SD8、SD9.

2.1 菌株形态学观察结果

表1 细菌形态学特征

续表1

2.2 菌株生理生化实验结果

表2 大豆根系细菌生理生化特征

表3 水稻根系细菌生理生化特征

2.3 细菌种属鉴定

利用《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)，根据菌株的形态学特征和生理生化特征对实验菌株进行种属的鉴定，鉴定结果见表4.

表4 大豆根系和水稻根系细菌菌属鉴定结果

2.4 大豆根系和水稻根系土壤细菌数量分析

在所取的土壤样品中，2007年秋季取样每克大豆根系干土中含细菌约为3.41×106个，每克水稻根系干土中含细菌约为3.45×106个;2008年春季取样每克大豆根系干土中含细菌约为19.4×106个，每克水稻根系干土中含细菌约为14.4×106个.分析可能是由于植物的生长利用了土壤中的大部分营养成分，所以秋季土壤中的营养成分相对来说较少，虽然植物残体较多，但还未转化成可被微生物所能利用的成分，加之土壤温度变低，也不利于微生物的生长繁殖，因而细菌数量相对较少.而在春季的土壤中，因为腐殖质含量多，营养丰富，大多可被微生物所利用，而且土壤温度也在回升，有利于微生物的快速繁殖，所以细菌数量也相对较多.因此无论是在大豆根系还是水稻根系中，春季土壤要比秋季土壤中细菌数量多.

2.5 土壤理化性质对不同根系土壤细菌的影响分析

不同根系土壤具有不同的理化性质，如土壤的有机质含量、含氮量、pH、含水量都会影响土壤中细菌的生长和繁殖，从而影响根系土壤中细菌的数量及分布.大豆根系和水稻根系土壤样品的细菌数量与土壤理化性质的关系如表5及图1所示.

表5 不同土壤理化性质特征及细菌数量分布

图1 细菌数量与土壤理化性质关系图

由图1和表1－5可知，水稻根系土壤中细菌数量明显大于大豆根系土壤中细菌数量，而土壤样品含氮总量相差不大，由于水稻根系土壤含水量较高，pH较高，适于细菌的生长与繁殖，但土壤有机质含量相对较低，可能是由于水稻根系土壤所含有机物质较少，而大豆根系土壤疏松，有机物质含量相对较高，但并未转化为可被微生物利用的营养成分，所以细菌数目相对较少.

3 结论

该研究通过对三江平原大豆根系和水稻根系土壤中的细菌进行分离，分别从大豆根系土壤中得到 7株细菌，分别编号为 DD1、DD2、DD3、DD4、DD5、DD6、DD7;从水稻根系土壤中得到 9株细菌，分别编号为 SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6、SD7、SD8、SD9.

根据细菌形态学特征及其生理生化特性，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》对这16株细菌进行了初步鉴定，结果表明，大豆根系土壤中主要分布着芽孢杆菌属、黄单胞菌属、气单胞菌属、甲基单胞菌属、假单胞菌属、根瘤菌属6个菌属;水稻根系土壤中分布着微球菌属、黄杆菌属、根瘤菌属、奈瑟氏球菌属、葡萄球菌属5个菌属.

通过对2007年秋季和2008年春季两个季度大豆和水稻根系土壤中细菌数量的分析及土壤理化性质对细菌数量的影响，发现无论是大豆根系还是水稻根系中，春季土壤中的细菌数量较秋季土壤中的细菌数量多，而在同一时期水稻根系土壤中细菌数量明显大于大豆根系土壤中细菌数量，并且土壤细菌数量与土壤含水量、有机质含量、pH等都有一定的相关性.

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Islation and Identification of Microoganism from Soil around Soy bean Roots and Rice Roots in Sanjiang Plain

Wu Daoqin，Wang Jihua，Liu Shuli，Niu Jia，Chen Dinghua
(Harbin Normal University)

Soil around soy bean roots and rice roots contains different types of microbes，among which the quantity of bacteria is the largestest，actinomyce is the second，and fungi is the smallest.The total number of soil microoganism around roots is much larger than that outside roots.Microbes from soil around soy bean roots and rice roots in Sanjiang Plain are isolated and initially identified according to the individual and colony character and physiology and biochemistry reaction.The result shows that there are six dominant genus in the soil around soybean roots:Bacillus， Xanthomonas， Aeromonas， Methylomonadaceae，Pseudomonas，and Rhizobium;the soil around rice roots contains five dominant genus:Micrococcu，Flavobacterium，Rhizobium，Neisseria and Staphylococcus.Meanwhile，effection of part of soil physical and chemical characters on soil microoganism around soybean and rice roots is discussed，relation between bacteria number around roots and soil moisture，organic matter content and pH is clarified，which provide guidence for fertilization of soybean and rice field and increase of food production in the future.

Soybean roots;Rice roots;Soil;Bacteria;Separation;Identification

2011－10－11

*哈尔滨师范大学大学生实践创新基金(20100078)

* 通讯作者，wangjihua333@hotmail.com

(责任编辑:李家云)