山芝烯二醇对体外培养成骨细胞成骨活性的影响

王朝元，唐俊龙，魏甜甜，宋 超，杨光忠

(1 中南民族大学 生命科学学院， 武汉 430074；2 中南民族大学 药学院， 武汉 470074)

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

山芝烯二醇由中南民族大学药学院提供.DMEM/High Glucose(Thermo)，小牛血清(四季青)，胰蛋白酶、二甲基亚砜(Amresco)，MTT(Amerro)，ALP试剂盒(南京建成生物科技公司)，Trizol(Invitrogen)，PCR引物(武汉博越技术有限公司)，反转录试剂盒(Fermentas)，SYBR Green荧光染料(TOYOBO),昆明种小鼠(湖北省疾病控制中心).

CO2培养箱(HF90/240型，利康生物医疗科技控股集团)，倒置显微镜(Motic AE21型，重庆光学仪器)，酶联免疫检测仪(MULTISKAN ASCENT 354 型，THERMO)，可见分光光度计(721型，上海光学仪器)，普通PCR仪(Biometra，德国)，凝胶成像分析仪 (JS-380A，上海培清科技)，荧光定量PCR仪(Rotor-gene 2000，Corbett research 澳大利亚).

1.2 山芝烯二醇的分离纯化及其贮存液的制备

从玉柏石松中分离纯化山芝烯二醇[5]，称取山芝烯二醇粉末，用二甲基亚砜溶解，使其终浓度为1.6×10-3mol/L，用0.22 μm滤膜过滤除菌.于4℃冰箱保存.

1.3 原代小鼠颅骨成骨细胞培养

分离出生3d的昆明小鼠的颅骨，剪碎后用0.1%的胰蛋白酶消化40 min，加入5mL含有10%新生小牛血清的DMEM，1500 r/min，5 min离心弃上清，将沉淀转入到培养瓶中加入DMEM，于37℃、5%CO2培养箱中培养.

1.4 山芝烯二醇对成骨细胞增殖率的影响

取第二代成骨细胞，按1.0×104细胞/孔接种于96孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养2h.待细胞贴壁后更换培养基，加入终浓度分别为1，2，4，8μmol/L的山芝烯二醇.设不加药为对照组，每组5个复孔.分别在加药后培养0 d(细胞接板2h贴壁)，1d，3d，每孔加入20μL MTT，置37℃、5%CO2培养箱中反应4h.小心吸出上清，每孔加入150μL DMSO，用移液器反复吹打并置37℃培养箱中10 min充分溶解紫色结晶.用酶标仪测定OD492.

1.5 山芝烯二醇对成骨细胞ALP活性的影响

取原代培养成骨细胞，按2.0×104细胞/孔接种于24孔板中.置于37℃、5%CO2培养箱中培养2h.待细胞贴壁后换成诱导培养基(普通培养基中加入终浓度为50μg/mL维生素C、10mMβ-甘油磷酸钠、10-8mol/L地塞米松)培养，分别加入加入终浓度为1，2，4，8μmol/L的山芝烯二醇.设不加药为对照组，每组3个复孔.培养3，6，9 d后，每孔加100μL 0.1% Triton X-100裂解过夜，用ALP试剂盒测定ALP活性.

1.6 山芝烯二醇对成骨细胞早期分化相关基因表达的影响

取原代培养成骨细胞，按1×105细胞/孔接种于6孔板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养2 h.细胞贴壁后换诱导培养基培养.加入终浓度为2，4μmol/L的山芝烯二醇.如1.5设复孔和对照.培养3,6,9 d后，用Trizol法提取细胞总RNA，通过反转录试剂盒合成cDNA，以此为模板进行荧光定量PCR.每个样品重复3次，通过2-ΔΔCt法[6]计算药物对相关基因c-jun、c-fos、Osterix、Col-Ⅰ、ALP、OC(引物见表1)表达的影响.

表1 骨相关基因定量PCR引物序列

1.7 统计分析

根据公式F=2﹣[(待测组目的基因平均Ct值-待测组内参基因平均Ct值)-(对照组目的基因平均Ct值-对照组内参基因平均Ct值)],计算出目的基因的相对表达量.用单因素方差分析(one-way ANOVA)对结果进行显著性差异分析.

响应面法优化山药饮片多糖的提取条件……………………………………………………… 李 静，操庆国，韩艳丽，凡军民（118）

2 结果与分析

2.1 山芝烯二醇对成骨细胞增殖率的影响

山芝烯二醇对成骨细胞增殖的影响见图1.由图1可见，药物处理1 d时，1 μmol/L的山芝烯二醇无明显的促进作用(P>0.05)，而其他各浓度均对成骨细胞的增殖有明显的促进作用(P<0.05).3d时，各浓度药物均显著促进成骨细胞的增殖(P<0.01).

1) control； 2-5)依次为1，2，4，8μmol/L山芝烯二醇与对照组比较，* P<0.05，**P<0.01，n=5

2.2 山芝烯二醇对成骨细胞ALP活性的影响

山芝烯二醇对成骨细胞ALP活性的影响见图2.由图2可见，药物处理3 d时，8 μmol/L药物抑制成骨细胞ALP活性(P<0.01)，其他浓度无显著影响(P>0.05).6 d时， 1 μmol/L药物抑制成骨细胞ALP活性(P<0.05)，其他浓度无显著影响(P>0.05).9 d时，高浓度(2，4，8μmol/L)的药物均显著促进成骨细胞ALP活性(P<0.05)，低浓度(1μmoL)则对其无显著影响(P>0.05).

1) control； 2-5)依次为1，2，4，8μmol/L山芝烯二醇与对照组比较，* P< 0.05，**P<0.01，n=3

由2.1和2.2可知， 2,4 μmol/L的山芝烯二醇最能促进成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶活性，故选此2个浓度进一步研究其对成骨细胞成骨活性相关基因表达的影响.

2.3 山芝烯二醇对骨相关基因表达的影响

山芝烯二醇对c-jun基因表达影响见图3.由图3可见，药物处理3 d时，2 μmol/L的山芝烯二醇促进c-jun基因表达(P<0.05)，4 μmol/L的山芝烯二醇对c-jun无显著影响(P>0.05).6 d和9 d时，2种浓度的山芝烯二醇对c-jun均无显著影响(P>0.05).

1) control； 2-3)依次为2，4μmol/L山芝烯二醇与对照组比较，* P< 0.05，**P<0.01，n=3

山芝烯二醇对c-fos基因表达影响见图4.由图4可见，药物处理3 d时，2 ，4 μmol/L的山芝烯二醇均促进c-fos表达(P<0.05).6 d和9 d时，2种浓度的山芝烯二醇对成骨细胞的c-fos均无显著影响(P>0.05).

1) control； 2-3)依次为2，4μmol/L山芝烯二醇与对照组比较，* P< 0.05，**P<0.01，n=3

山芝烯二醇对Osterix基因表达影响见图5.由图5可见，药物处理3 d时， 4 μmol/L药物抑制Osterix表达(P<0.05)，2 μmol/L药物对Osterix无显著影响(P>0.05).6 d和9 d时，2个浓度药物均促进Osterix表达(P<0.05).

1) control； 2-3)依次为2，4μmol/L 山芝烯二醇与对照组比较，* P< 0.05，**P<0.01，n=3

山芝烯二醇对ALP基因表达影响见图6.由图6可见，药物处理3 d和6 d时，2种浓度药物对ALP均无显著影响(P>0.05).9 d时，2种浓度药物促进ALP表达(P<0.05).

1) control； 2-3)依次为2，4μmol/L 山芝烯二醇与对照组比较，* P< 0.05，**P<0.01，n=3

山芝烯二醇对Col-Ⅰ基因表达影响见图7.由图7可见，药物处理3 d和6 d时，2 μmol/L药物促进Col-Ⅰ表达(P<0.05)，4 μmol/L药物对其表达无显著影响(P>0.05).9 d时，2种浓度药物均促进Col-Ⅰ基因表达(P<0.05).

1) control； 2-3)依次为2，4μmol/L山芝烯二醇与对照组比较，* P< 0.05，**P<0.01，n=3

山芝烯二醇对OC基因表达影响见图8.由图8可见，药物处理3 d和6 d时，各个浓度无显著影响(P>0.05).9 d时，2μmol/L药物抑制OC基因表达(P<0.05)，4μmol/L药物对OC表达无显著影响(P>0.05).

1) control； 2-3)依次为2，4μmol/L山芝烯二醇与对照组比较，* P< 0.05，**P<0.01，n=3

3 讨论

成骨细胞在骨形成过程中经历分裂增殖、分化和基质钙化3个阶段[7].本实验以体外培养成骨细胞为模型，研究玉柏石松提取物山芝烯二醇对成骨细胞增殖和分化的影响.

实验中山芝烯二醇短期处理(1 d和3 d)可促进成骨细胞增殖，短期处理(3 d和6 d)ALP活性影响不大，但长期处理(9 d)时，2，8 μmol/L的山芝烯二醇均显著促进ALP活性.由于ALP是成骨细胞分化的早期标志[8]，说明山芝烯二醇不仅可以促进成骨细胞的增殖，还可以促进成骨细胞的分化.

在成骨细胞的分裂增殖过程中一些基因的表达具有十分重要的意义.其中c-jun、c-fos是原癌基因，它编码的蛋白是构成转录激活因子AP-1的重要组成部分，而AP-1转录因子是重要的基因表达调节因子，与细胞的增殖和转化密切相关[9-11].细胞从颅盖骨中分离后很快出现最高水平c-fos基因表达，而c-jun、c-fos基因表达在增殖晚期明显下调，同时伴随成骨细胞增殖减慢，细胞由增殖期进入分化期[12].实验中2 μmol/L和4 μmol/L的山芝烯二醇对c-jun、c-fos基因表达的影响趋势相同：早期处理(3 d)促进其表达，长期处理(6～9 d)无明显作用，与MTT结果一致.

Osterix基因是Nakashima[13]等发现的仅在发育的骨组织中特异性表达的转录因子，是早期成骨细胞分化和骨形成过程中必需的转录因子.实验中山芝烯二醇长期处理(6～9 d)可以显著促进Osterix表达，9 d效果更显著.说明山芝烯二醇处理后，成骨细胞内c-jun、c-fos等转录因子首先被激活，Osterix等骨特异分化因子随之被激活，促进成骨细胞分化成熟.

骨基质是由成骨细胞分泌的蛋白质所形成的，其中碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、骨钙素(OC)等蛋白质对基质的成熟和矿化起到了重要作用.实验中山芝烯二醇长期处理(9 d)促进ALP基因表达，短期处理(3～6 d)则无明显作用，与ALP活性实验结果相符.Col-Ⅰ是骨中的有机基质模板，是骨基质的主要有机成分[14].2 μmol/L的山芝烯二醇在3～9 d内均促进Col-Ⅰ基因表达，而4 μmol/L的山芝烯二醇在9 d时才有促进作用.与Col-Ⅰ不同，2 μmol/L 山芝烯二醇处理9 d对OC基因的表达无显著促进作用，反而有一定抑制作用.具体机理尚待进一步研究.

综上所述,山芝烯二醇早期促进成骨细胞增殖、晚期促进ALP活性，并能影响成骨关键基因的表达和促进成骨细胞的早期分化.其机制是首先通过促进成骨细胞内c-jun、c-fos等转录因子的表达，激活Osterix基因，进而促进ALP和Col-I等基因的表达，促进成骨细胞分化成熟.因此，山芝烯二醇具有成骨活性，是玉柏石松促进成骨的有效成分之一.

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