大肠癌中miRNA-20a的表达与TNM分期和淋巴结转移相关性研究

马群英，江美玲，马凤丽，李 钊，许岸高

(1.南方医科大学附属南方医院胃肠科，广州 510515；2.惠州市第一人民医院/惠州市医学研究所 516001)

大肠癌是世界上第三大肿瘤，也是导致肿瘤性死亡的第三大原因，其年新发病例大约为100万，年病死人数超过50万[1]。近年来，由于中国人民生活方式、饮食结构、环境因素等的改变，大肠癌的发病率及病死率呈逐年上升趋势。因而对大肠癌发生、发展机制的进一步研究，以寻求新的诊断及治疗靶标十分必要。microRNAs(miRNAs)是近年来发现的长约21～25 nt单链RNA，它通过与靶mRNA不完全互补配对抑制蛋白翻译，在基因表达调控包括肿瘤形成和发展中扮演重要角色[2]，它的出现让人们看到了大肠癌的诊断和治疗的新曙光。本文通过探针法逆转、实时定量PCR检测52例肠癌中miRNA-20a的表达，分析其与分期及其临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择惠州中心医院52例大肠癌患者外科手术切除的新鲜肠癌组织及其相应癌旁正常组织，术后经病理检查确证。组织获得后立即置于-80 ℃超低温冰箱。所有患者术前均未行放、化疗与免疫治疗。其中，男25例，女27例；年龄28～84岁，平均59.9岁。TNM分期以美国癌症联合委员会(AJCC)/国际抗癌联盟(UICC)结直肠癌TNM分期系统(第6版)为标准。

1.2方法

1.2.1主要试剂 TRIzol试剂购自Invitrogen， miRNA-20a RT Primer、miRNA-20a Real time、U6 RT Primer、U6 Real time、2×PCR TaqMan Universal PCR，TaqMan MicroRNA Reverse Transcription kit 均购自ABI公司。

1.2.2组织总RNA提取 -80 ℃超低温冰箱保存组织(30 mg)，于冰上碾磨器磨碎，加入1 mL TRIzol试剂，按说明书操作提取总RNA,Nanodrip(ND-1000,USA) 检测RNA溶液A260/280 nm比值及浓度，取A260/280 nm在1.8～2.1者进一步试验。

1.2.3cDNA合成及实时定量PCR检测 取100 ng总RNA按试剂说明书操作逆转录cDNA：反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。然后按2×PCR TaqMan Universal PCR 试剂盒说明，以miRNA-20a 和 U6 第一链为模板，用miRNA-20a 和 U6 荧光探针为引物扩增。以上荧光 PCR 检测均在ABI PRISM 7500(Applied Biosystems,USA)型荧光定量PCR仪操作完成，所有反应设立3个复孔，检测方法为相对定量分析2-△△Ct法。

1.3统计学处理 采用SPSS13.0软件进行统计分析。根据Q-Q图、偏峰度计算和Kolmogorov-SmiRnov检验(D检验)推断数据不符合正态分布，数据均采用非参数检验，数据以中位数(25％分位数至75％分位数)表示。配对资料采用配对资料的wilcoxon符号秩和检验(wilcoxonsigned-ranktest)，miRNAs与其他临床病理资料的检验组间比较采用Mann-whitney检验，分析miRNAs与等级变量相关关系采用Jonchheere-Terpstra检验。以P<0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1miRNA-20a在肠癌组织中高表达 采用TaqMan®探针法实时定量PCR检测miRNA-20a表达，以U6为内参，2-△△Ct法分析肠癌组织相对癌旁正常组织的相对表达量。miRNA-20a在65％(34/52)的肠癌组织中高表达；与癌旁正常组织比较，miRNA-20a在肠癌组织中的相对表达量为2.05，高于癌旁正常组织(图1)，差异有统计学意义(Z=-3.597，P=0.000)。

图1 miRNA-20a在大肠癌中的表达

图2 miRNA-20a在不同TNM分期中的表达

图3 miR-20在淋巴结阴/阳性组织中的表达

2.2miRNA-20a表达水平与TNM分期和淋巴结转移相关 miRNA-20a的表达在TNM不同分期中表达差异有统计学意义(T=3.223,P=0.001)。随着TNM分期越高，miRNA-20a表达越高(图2，表1)。有淋巴结转移肠癌组织中miRNA-20a表达明显高于无淋巴结转移者(Z=-2.141,P=0.037)(图3，表1)。miRNA-20a表达和性别、年龄、肿块位置、组织分化程度无关，见表1。

表1 大肠癌中miRNA-20a的表达与临床病理特征的关系

1：miRNAs相对表达的中位数，括号中表示25％及75％百分位数；2：以结肠脾曲为界分为近端结肠及远端结肠。

3 讨 论

一种miRNAs可以调节多种靶基因，同一靶基因也可通过不同miRNAs调节，同时，miRNAs也可被各种调节因子所调节，miRNAs调节因子、miRNAs及其靶基因构成了错综复杂的基因调节网络，而肿瘤中差异表达的miRNAs也可通过交叉的网络促进肿瘤的发生、发展。miRNAs的发现及其研究的深入，为了解复杂的基因网络调控机制开辟了新的领域，也为癌症的早期筛查、诊断、治疗等方面提供新的理论基础及方法。

miRNA-20a是miRNA-17-92家族一员，其在不同肿瘤中作用不同。miRNA-20a在前列腺癌，尤其是低分化前列腺癌中表达较高[3-4]，前列腺癌细胞系过表达miRNA-20a后凋亡减少；miRNA-20a也可通过调节Fas表达增加骨肉瘤细胞转移能力[5]；miRNA-20a还可调节淀粉样前蛋白促进卵巢癌细胞增殖和侵袭[6]。以上研究证实miRNA-20a具有致癌作用，同时，miRNA-20a也具有抑癌作用。miRNA-20a过表达可抑制胰腺癌细胞增殖和转移[7]；miRNA-20a在乳腺癌细胞中表达降低，可抑制细胞侵袭及转移[8]，乳腺癌术后miRNA-20a表达下降[9]，还可通过下调Cyclin D1表达而抑制乳腺癌细胞增殖和克隆形成[10]。因而miRNAs在不同基因背景中作用不同，一种miRNA在某一癌症中作用需结合组织表达、生存分析及细胞动物实验等验证，以确定其促癌或抑癌作用，从而为将来临床治疗应用等提供理论指导。

本研究证实miRNA-20a在肠癌中表达增加，与癌旁正常组织相比，差异有统计学意义(P<0.05)。有研究证实miRNA-20a在肠癌组织的高表达[11-13]，与本研究结果一致。同时，本研究结果表明肠癌组织中miRNA-20a还与TNM分期和淋巴结转移相关，说明miRNA-20a可能参与调节大肠癌转移过程。且有文献报道miRNA-20a高表达与生存期降低有关[14]；敲低SW620细胞中miRNA-20a可增加化疗敏感性，而过表达SW480中miRNA-20a可导致化疗抵抗[15]。可见，miRNA-20a在大肠癌中的作用文献报道趋于一致，即miRNA-20a在大肠癌中高表达，与患者生存期及化疗抵抗有关，在大肠癌中可能具有促癌作用。

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