野桑蚕漆酶基因克隆、序列分析及转录表达谱研究

张永亮，武安泉，盛东峰，张 杰

（周口师范学院 生命科学系，河南 周口 466001）

野桑蚕漆酶基因克隆、序列分析及转录表达谱研究

张永亮＊，武安泉，盛东峰，张 杰

（周口师范学院 生命科学系，河南 周口 466001）

利用RT－PCR方法，克隆了野桑蚕Bombyx mandarina漆酶基因，获得了其cDNA序列.该序列长2 317bp，含有一个2 295bp的完整开放阅读框，有8个外显子，7个内含子，编码一个由764个氨基酸残基组成的蛋白质，其蛋白质的分子量和等电点分别为84 340.91和6.61.推导的氨基酸序列与其它鳞翅目昆虫（Laccase）基因相应氨基酸序列有较高的同源性，该序列具有它们的漆酶基因所共有的典型特征.组织特异性表达分析表明了该基因仅在野桑蚕的表皮、头部、中肠和血液中有表达.这些结果为进一步研究野桑蚕漆酶基因的功能提供了分子基础.

野桑蚕；漆酶基因克隆；序列分析；转录表达

漆酶（Laccase）是一种含铜离子结合位点的多酚氧化酶，能够催化酚类物质氧化形成醌，将氧还原成水，醌和自由基产物一起经过非酶促耦合反应生产黑色素［1-2］.它广泛存在于生物体内，人们已从植物、细菌和真菌等中提取了漆酶，并对其结构、性质及功能进行了研究［3-11］，但对昆虫漆酶的研究报道极少.漆酶主要参与昆虫表皮的硬化过程，对昆虫的成活至关重要［12］.迄今尚未见有关野桑蚕漆酶基因的研究报道，本实验通过对野桑蚕漆酶基因的克隆、序列分析及转录表达谱研究，旨在为进一步了解该基因的功能奠定基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

野桑蚕采集自重庆市北碚区家蚕饲养场.

1.2 总RNA的提取及cDNA第1链的合成

实验材料采集后，提取各组织器官，超低温冷冻保存备用.用Trizol试剂（Invitrogen公司产品）提取野桑蚕5龄幼虫第3天各组织的总RNA，所有操作严格按照说明书进行.cDNA第1链按cDNA合成试剂盒的操作方法，在M－MLV反转录酶（Promega公司产品）的作用下合成.实验所用的各组织器官如下：野桑蚕5龄幼虫第3天的中肠、头部、卵巢、精巢、丝腺、血液、脂肪体、表皮、马氏管.

1.3 野桑蚕漆酶基因的分子克隆及DNA测序

根据登录在基因库上家蚕漆酶基因开放阅读框的全长序列设计1对特异引物，用于扩增野桑蚕漆酶基因开放阅读框序列.正向引物序列：5′TGTGTGTTAACATGGGGTGCA 3′；反向引物序列：5′CTAGGAACCGTTCAGTGGAGT 3′.PCR 扩增条件为：94℃预变性5min，然后94℃循环变性0.5min、55℃退火0.5min、72℃延伸3min，共30个循环，再72℃终延伸10min.取来自表皮的PCR产物进行1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，按胶回收试剂盒（华舜公司产品）说明进行回收.将回收纯化后的产物与pMD18－T载体（Takara公司产品）连接，重组质粒转化入大肠杆菌DH5α感受态菌株后，通过蓝白斑筛选，将阳性克隆菌液送上海生工生物工程有限公司测序.

1.4 核苷酸和氨基酸的序列分析

用PHRAP软件（http：／／www.phrap.org）对得到的cDNA序列拼接成完整的开放阅读框全长序列.利用ExPaSy工具（http：／／www.expasy.org／tools／dna.html）将完整开放阅读框的cDNA序列翻译成其相应的氨基酸序列.用Clustal X［13］将野桑蚕的氨基酸序列与其它昆虫的相应氨基酸序列进行比对，在SMART（http：／／smart.emblheidelberg.de／）网站预测其功能域.在http：／／au.expasy.org／tools／网站预测其蛋白质的等电点和分子 量，用 http：／／www.ch.embnet.org／software／TMPRED＿form.html软件计算其疏水性.

1.5 野桑蚕漆酶基因RT－PCR表达模式分析

根据已获得的野桑蚕漆酶基因保守序列的cDNA片段设计1对特异引物，用于RT－PCR检测野桑蚕漆酶基因的表达模式.正向引物为：5′GTAATGCTGGCACTCACTTCT 3′；反 向 引 物为：5′TGGTAAGGTCCTCTAGCGTAT 3′.PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃循环变性0.5min、55℃退火0.5min、72℃延伸1min，25个循环.最后再72℃终延伸10min.根据家蚕Actin3基因全序列，设计2个半定量内标基因的引 物：P1 5′－CATGAAGATCCTCACCGAGCG－3′；P2 5′－CGTAGCACAGCTTCTCCTTGATA－3′.PCR反应体系和扩增条件同上，PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测.

2 结果与分析

图1 野桑蚕漆酶基因部分cDNA片段凝胶电泳图1泳道：RT－PCR扩增得到的片段；M：DL4500markerFig.1 Agarose gel analysis of Bombyx mandarina laccase partial cDNA fragments amplified by RT－PCR

2.1 野桑蚕漆酶基因的分子克隆及核苷酸序列分析

以野桑蚕5龄幼虫第3天表皮组织的cDNA为模板，用RT－PCR的方法对野桑蚕漆酶基因进行克隆、测序，获得了长约2 317bp的片段（见图1），该片段含有2 295bp的开放阅读框全长序列.完整开放阅读框的位置在12～2 306bp，起始密码为ATG，终止密码为TGA，编码764个氨基酸残基.功能域预测表明该开放阅读框含有1个保守的信号肽序列，位于图2中的1～23氨基酸残基处，曲线标明；3个公认的高度保守的铜氧化酶功能域结构序列，分别位于图2中的200～314、327～480及581～742氨基酸残基处，下划线标明.使用BLAST程序将漆酶基因的cDNA序列与家蚕基因组序列比对，结果显示该基因有8个外显子，7个内含子，并且外显子和内含子边界符合GU－AG规则.预测该蛋白酶的分子量和等电点分别为84340.91和6.61，氨基酸序列的C－末端有疏水跨膜区域.

2.2 野桑蚕漆酶氨基酸序列分析

昆虫体内的漆酶具有不同的亚型，通过氨基酸序列比对分析表明漆酶基因不同亚型之间有不同程度的一致性，本研究的野桑蚕漆酶基因的氨基酸序列与其他昆虫Laccase2基因相应的氨基酸序列同源性较高，而与其Laccase1的同源性较低.如与烟草天蛾Laccase2和Laccase1（蛋白质序列号分别为AAN17507.1 和 AAN17506.1）的一致性分别为93%、38%；与家蚕Laccase2和Laccase1（蛋白质序列号分别为NP 001103395.1和 DAA06286.1）的一致性分别为99%、39%；与桦尺蠖Laccase2（蛋白质序列号为AEP43806.1）的一致性为95%；与赤拟谷盗Laccase2和Laccase1（蛋白质序列号分别为NP 001034487.2和 NP 001034514.1）的一致性分别为75%、38%；与西方蜜蜂Laccase2（蛋白质序列号为ACK57559.2）的一致性为81%；与松墨天牛Laccase2（蛋白质序列号为 ABU68466.1）的一致性为74%；与冈比亚按蚊Laccase2A、Laccase2B、Laccase3（蛋白质序列号分别为 AAX49501.1、AAX49502.1、ABQ95972.2）的一致性分别为77%、74%和41%.

图2 野桑蚕漆酶基因的cDNA序列及其翻译的蛋白质序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of Bombyx mandarina laccase gene The amino acid sequence is given below the nucleic acid sequence

2.3 野桑蚕漆酶基因在不同组织中的转录表达谱

通过RT－PCR检测了漆酶基因在野桑蚕不同组织器官中的表达情况，结果表明该基因在表皮、头部和中肠均具有较高丰度的表达，在血液中仅有微弱的表达，而在其他组织器官中均未检测到表达（见图3）.

图3 野桑蚕漆酶基因在不同组织器官中的表达谱Fig.3 Expression profile of B.mandarina laccase gene in different tissues and organs of 5th instar

3 讨论

利用RT－PCR的方法获得了野桑蚕Laccase基因完整开放阅读框全长cDNA序列.大多数昆虫包括烟草天蛾、家蚕、冈比亚按蚊和赤拟谷盗等的Laccase基因都有2个亚型（Laccase1和Laccase2）或更多、3个高度保守的铜氧化酶结合位点、有信号肽序列，本研究取得了相似的结果.同源性分析表明本文获得的野桑蚕Laccase氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫Laccase2氨基酸序列的一致性较高（74% ～99%），与家蚕Laccase2氨基酸序列的一致性最高（99%），表明本研究得到的野桑蚕Laccase基因可能为Laccase2.在野桑蚕中是否也存在Laccase1基因或更多的亚型还有待进一步研究.此外，如上所述野桑蚕Laccase和家蚕Laccase2高度同源的事实进一步支持了家蚕起源于野桑蚕，家蚕是由野桑蚕进化而来的结论.

RT－PCR分析表明了野桑蚕Laccase的表达模式和其他昆虫具有一定的相似性，如Laccase mRNA在冈比亚按蚊的中肠、表皮及其幼虫、蛹和成虫期［14］，家 蚕 的 表 皮［15］，松 墨 天 牛 的 表 皮［16］，甲虫的预化蛹、蛹及成虫发育阶段［17］，烟草天蛾的预化蛹和0～3h蛹表皮［18］等均有表达，且表皮的表达量最高.这些研究结果进一步印证了漆酶在昆虫表皮的硬化过程中起着关键作用的结论.研究结果还提示了对于不同的物种，漆酶的组织表达可能存在一定的差异.推测不同组织或不同物种的漆酶可能具有不同的生理功能.

漆酶在昆虫的表皮硬化和对病原体及寄生虫的防御反应中起着重要作用，然而表皮硬化和防御反应对昆虫的成活至关重要［12］.因此，野桑蚕漆酶基因的分子克隆和表达谱分析为其功能研究、生物防治及家蚕的起源和进化等提供了分子基础.

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Cloning，sequence analysis and transcriptional expression profiles of Bombyx mandarina Laccase gene

ZHANG Yongliang，WU Anquan，SHENG Dongfeng，ZHANG Jie
（Department of Life Science，Zhoukou Normal University，Zhoukou，Henan 466001）

The complemental deoxyribonucleic acid（cDNA）of Bombyx mandarina Laccase gene was cloned by reverse transcription－polymerase chain reaction（RT－PCR）.The results showed that the cDNA with 2 317bp in length contained an open reading frame（ORF）of 2 295bp which encoded 764amino acid residues，contains 8exons and 7introns，and a predicted molecular weight of 84340.91and isoelectric point of 6.61.The deduced amino acid sequence had a high identity to the reported sequence of laccase2 from other lepidopterous insects and shared the typical structural features of laccase from other insects.The Laccase was only expressed in epidermis，head，midgut，and blood of B.mandarina by RT－PCR analysis.These results provide molecular basis for further studying the function of Laccase gene in B.mandarina.

Bombyx mandarina；Laccase gene cloning；sequence analysis；transcriptional expression

Q812

A

1000－1190（2012）04－0468－05

2012－03－10.

河南省教育厅自然科学基金项目（2010A230016）；周口师范学院博士科研启动基金资助项目；周口师范学院校级重点学科建设经费资助项目.

＊E－mail：zylxndx＠163.com.