琥珀酰化改性高溶解度大豆分离蛋白的工艺优化

王 月 张东杰

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319）

琥珀酰化改性高溶解度大豆分离蛋白的工艺优化

王 月 张东杰

（黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319）

采用琥珀酸酐对大豆分离蛋白进行酰化改性，测定改性前后大豆分离蛋白溶解特性的变化，并建立蛋白质溶解度与改性条件关系的数学模型，利用四元二次正交旋转组合设计试验法优化出琥珀酰化大豆分离蛋白的适宜条件：大豆分离蛋白质量分数7.0%，反应温度54℃，琥珀酸酐添加量11%，反应时间2h。该条件下制备的酰化蛋白的溶解特性与未改性的大豆分离蛋白相比提高了15.73倍。

大豆分离蛋白；琥珀酸酐；改性；功能特性

目前世界上生产的含有大豆蛋白的食品已超过了12 000多种。由于大豆分离蛋白（SPI）有乳化性、吸油性、吸水性与保水性、凝胶性和起泡性等功能特性，因此大豆分离蛋白质被广泛应用于焙烤食品、乳品、肉制品及肉的代用品等食品工业领域，也使SPI功能特性的改善成为目前该领域的研究热点［1］。

目前中国大豆分离蛋白企业存在的问题主要是新产品开发滞后，品种较为单一，应用领域窄，产品附加值低；产品质量远低于国际水平，尽管价格较低，但销量仍然无法提高，竞争能力偏弱。研究［2］表明，经过琥珀酰化的大豆分离蛋白的功能特性有明显提高：乳化活性提高了30%；乳化稳定性提高了20%；乳化量提高了3倍；起泡性提高了20%；泡沫稳定性提高了50%；另有研究［3］发现，酰化改性可在一定程度上提高大豆分离蛋白的水溶性、乳化活性和乳化稳定性等功能特性，同时降低大豆分离蛋白质的等电点，相比较而言，琥珀酰化对大豆分离蛋白的功能性质影响要大于乙酰化。姚玉静等［4］系统的研究了大豆分离蛋白乙酰化改性，制得的乙酰化大豆分离蛋白产品在pH 5.0～9.5范围内能较大的提高蛋白质分子的发泡性能和乳化性能。

从理论上讲大豆分离蛋白氨基酸残基上的所有亲核基团都有发生酰化作用的可能性，实际则以赖氨酸的氨基最容易发生酰化反应。琥珀酰化和乙酰化改性均可增加大豆分离蛋白的比容［5］；而琥珀酰化改性还可使大豆分离蛋白的色泽由棕黄色变为白垩色，乙酰化改性则无此色泽变化。值得注意的是，酰化反应的程度要进行适当的控制，否则，会因为反应过度而造成大豆分离蛋白的功能特性下降。针对这一情况，本试验采用琥珀酸酐对大豆分离蛋白进行化学改性，并以溶解度为指标，通过单因素试验确定大豆分离蛋白质量分数、反应温度、琥珀酸酐添加量和反应时间对大豆分离蛋白功能特性的影响，确定各因素最适工作范围，同时进行四元二次回归正交旋转组合优化试验，利用SAS 8.2生物技术软件对试验数据进行处理分析，得到琥珀酰化改性大豆分离蛋白的最优工艺。测定其改性前后的溶解特性变化，以期为今后的工业化生产提出理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白（水分含量为6.47%，灰分为4.385%，蛋白质含量为74.57%，脂肪含量为0.90%）：大庆日月星有限公司；

琥珀酸酐：杭州中香化学有限公司；

牛血清蛋白：上海喜润化学工业有限公司；

其他试剂：均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

低速离心机：LD4－8，北京京立离心机有限公司；

精密定时电动搅拌器：JJ－1，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；

pH计：FE20，梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；

电热恒温水浴锅：DK－S24型，上海森信实验仪器有限公司。

紫外可见分光光度计：754型，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蛋白质溶解度的测定 双缩脲法［6］。

1.3.2 琥珀酰化大豆分离蛋白的制备 称取一定量大豆分离蛋白溶于水中，配成悬浮液并使其pH至8.0，在搅拌的条件下分多次等量缓慢加入琥珀酸酐。反应过程中用2mol/L NaOH溶液调节pH保持在8.0～8.5范围内，待pH稳定30min后结束反应，用去离子水透析（4℃，24h），然后喷雾干燥即得琥珀酰化SPI，备用［7］。

2 结果与分析

2.1 蛋白质溶解度标准曲线

由吸光度对牛血清蛋白浓度进行回归后，得到标准曲线方程为y＝0.487 9x＋0.004 3（y为吸光度；x为牛血清蛋白浓度，g/100mL），相关系数为R2＝0.994 8，见图1。

图1 蛋白质溶解度标准曲线Figure 1 The standard curve of protein solubility

2.2 四元二次正交旋转组合设计优化酰化条件

根据单因素试验得出的因素水平取值见表1，响应面设计方案及试验结果见表2。

表1 试验因素和水平表Table 1 Factors and coded levels of experiment

表2 响应面设计方案及试验结果Table 2 Results of orthogonality rotation combination experiments

通过表3可以得出回归方程如下：

表3 二次回归模型的参数Table 3 The parameter of quadratic regression model

由表4和表5可知，二次回归模型的F值为19.45，P值＜0.001，大于在0.01水平上的F（14，20）0.01＝3.07值；而失拟 项 的F值 为 0.60，小 于 在 0.05 水 平 的F（10，11）0.05＝2.86，由方程的显著性检验可知，该方程的模型达到极显著水平；失拟项P值＝0.783 3＞0.05，该方程无失拟因素存在，回归模型和试验值能较好的拟和。

表4 回归旋转正交组合方差分析表Table 4 The error analysis of two revolving orthogonal experiment

二次回归方程显著，并不意味着每一项对指标的影响都是重要的，还需要进一步对各项进行分析，从而确定哪些因素的一次项、二次项、交互项起到重要作用。对回归模型中各回归系数进行显著性检验，结果见表5，其中一次项，二次项，交互项F值均大于0.01水平上的F值，说明各个因素对酰化蛋白的溶解度有极其显著的影响。同时从表3可以看出x2、x3、x4因素的一次项，x1、x2、x3、x4因素二次项对改性蛋白的溶解度存在显著性影响，交互项x2x4的影响是极显著的（P值 ＜0.01），x1x4的影响则为显著（P值 ＜0.05）。

表5 回归方程各项的方差分析+Table 5 The analysis of variance every nuchal regression equation

为了进一步描述因素的变化与蛋白质溶解度之间的内在规律，可以通过在4个因素中固定二个变量进行降维分析，运用SAS 8.2软件可以绘出对改性大豆分离蛋白溶解度有显著影响的两个交互项x1x4、x2x4的三维交互效应曲面图和二维等高线图。

2.3 响应面分析结果

2.3.1 大豆分离蛋白质量分数与反应时间的交互效应分析

由图2可知，当大豆分离蛋白质量分数在4.5%～7.0%范围内时，反应时间在0.75～2.0h范围内时，两者存在显著的增效作用，溶解度随着大豆分离蛋白质量分数和反应时间的增加而增加。大豆分离蛋白质量分数在7.0%附近，反应时间在2h左右时，两者的协同作用达到最大。当大豆分离蛋白质量分数在7.0%～8.5%范围内时，反应时间在2.0～3.25h范围内时，溶解度随着大豆分离蛋白质量分数和反应时间的增加而下降，说明此时两者存在明显的拮抗作用。

2.3.2 反应温度与反应时间的交互效应分析 由图3可知，当反应温度在37.5～54℃范围内时，反应时间在0.75～2h范围内时，两者存在显著的增效作用，溶解度随着反应温度和反应时间的增加而增加。反应温度在54℃附近，反应时间在2h左右时，两者的协同作用达到最大。当反应温度在54～62.5℃范围内时，反应时间在2～3.25h范围内时，溶解度随着反应温度和反应时间的增加而下降，说明此时两者在此区间存在明显的拮抗作用。

2.4 验证实验

根据回归模型得出最佳酰化条件及酰化蛋白的溶解度见表6。

图2 大豆分离蛋白质量分数与反应时间等高线图和响应面图Figure 2 SPI quality socre and times in response to the surface map and contour map

图3 反应温度与反应时间等高线图和响应面图Figure 3 Reaction temperature and time in response to the surface map and contour map

采用上述优化后的酰化反应工艺条件，即大豆分离蛋白质量分数7%，反应温度54℃，琥珀酸酐添加量11%，反应时间2h，pH保持在8.0～8.5范围内，对酰化改性大豆分离蛋白进行3次重复验证实验，得出酰化蛋白的平均溶解度为1.054 106g/100mL，与SAS 8.2软件统计分析给出的最大溶解度1.060 809g/100mL的误差范围小于5%，因此，验证实验结果正确。与未改性大豆分离蛋白溶解度0.067g/100mL相比较提高了15.73倍。

表6 酰化条件的优化值及最优条件下酰化蛋白的最大溶解度Table 6 Optimum conditions of anhydride conditions and the largest solubility under optimal conditions

3 结论

（1）本试验在单因素试验基础上进行四元二次正交旋转组合设计优化酰化条件。获得最佳酰化条件的具体值分别为大豆分离蛋白质量分数7.0%，反应温度54℃，琥珀酸酐添加量11%，反应时间2h。

（2）采用降维的分析方法，获得各因素与酰化蛋白溶解度的关系。通过分析大豆分离蛋白质量分数与反应时间的交互效应，获得大豆分离蛋白质量分数在7.0%附近，反应时间在2h左右时，两者的协同作用达到最大。通过分析反应温度与反应时间的交互效应，获得反应温度在54℃附近，反应时间在2h左右时，两者的协同作用达到最大。

（3）通过琥珀酰化改性制得的大豆分离蛋白与未改性的蛋白相比较溶解度提高了15.73倍。

1 梁宇柱，张存劳，史晓峰.大豆蛋白质资源的开发与利用［J］.中国油脂，1998，23（5）：29～30.

2 黄纪念.大豆蛋白的功能特性及其改性动向［J］.食品工业，1997（3）：8～10.

3 赵国华，熊正俊.酰化对大豆蛋白结构和功能性质影响［J］.粮食与油脂，2001（9）：5～7.

4 姚玉静，杨晓泉.乙酰化大豆分离蛋白的功能特性研究［J］.中国调味品，2001（9）：16～19.

5 洪庆慈.大豆蛋白的功能性质与改性研究［J］.粮食与饲料工业，2001（3）：34～35.

6 姚玉静，杨晓泉，唐传核，等.酰化对大豆分离蛋白水合性质的影响［J］.食品与机械，2005，22（4）：19～21.

7 Eladawy T A.Functional properties and nutritional quality of acetylated and succinylatedmung bean protein i－solate［J］.Food Chem.，2000（70）：83～91.

Optimization on technological of high solubility SPI by succinylation modified

WANG YueZHANG Dong－jie

（Food College，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing，Heilongjiang163319，China）

Succinic anhydride was used as modification reagents to modified soy protein isolate.Determine the change of solubility properties before and after modification，and established the mathematical model between solubility of protein and modified conditions.Using response surface analysis to optimize the best conditions of parameters：mass fraction of soy protein isolate：7.0%，reaction temperature 54℃，succinic anhydride 11%，reaction time 2h.Under these conditions the functional properties of succinylated SPI were improved compared with the pre－modified SPI，respectively，and solubility increased 15.73degrees.

soybean protein isolated；succinic anhydride；modification；functional characteristics

10.3969/j.issn.1003－5788.2011.03.037

黑龙江省自然科学基金项目（编号：ZJN0505－01）；黑龙江省科技厅项目（编号：GB05C101－01）

王月（1984－），女，黑龙江八一农垦大学在读硕士研究生。E－mail：wangyue0711＠yahoo.com.cn

张东杰

2011－03－01