基于线粒体COI序列分析对紫贻贝群体遗传多样性的研究分析

沈玉帮，张俊彬，冯冰冰，李家乐

（上海海洋大学 教育部水产动物种质资源的挖掘与利用重点实验室, 上海 201306）

基于线粒体COI序列分析对紫贻贝群体遗传多样性的研究分析

沈玉帮，张俊彬，冯冰冰，李家乐

（上海海洋大学 教育部水产动物种质资源的挖掘与利用重点实验室, 上海 201306）

本文采用线粒体COI基因序列分析对我国沿海6个紫贻贝群体124个个体的遗传多样性和群体结构进行了初步研究。在紫贻贝6个群体中共发现13个单倍型和33个核苷酸多态位点。青岛群体单倍型数目是最多的，温州群体、丹东群体和宁德群体次之。6个紫贻贝群体的基因多样性为0.569～0.821，核苷酸多样性为0.015 5～0.051 0，表现出较低的遗传多样性。紫贻贝不同群体之间的遗传分化较小，所有群体之间没有发生显著的遗传分化。分子方差分析表明，紫贻贝的变异主要存在于群体内。该研究为紫贻贝的可持续开发和资源保护提供了一定的理论依据。

紫贻贝；线粒体COI基因；遗传多样性

群体异质性是生物持续存在的内在因素[1]。研究群体遗传结构是某一群体长期的可持续保护和管理的重要组成部分，另外，由于在生物进化研究中的作用，群体遗传结构已经引起了很多科研工作者的兴趣[2]。当群体遗传结构被确定后，将为我们及时地恢复资源提供必要的信息，还可以在养殖管理过程中对群体进行监控，特别是那些已经被开发的海洋生物。

紫贻贝（Mytilus galloprovincialis）属于贻贝属，在世界上分布范围非常广，原分布于英国和爱尔兰的南部沿海到法国、伊比利亚岛、地中海和黑海。除了这些地方之外，在加利福尼亚、澳大利亚、新西兰、塔斯马尼亚、日本、中国东部沿海和南非等地也有报道[3]。而在中国，紫贻贝是中国人工养殖的重要的经济贝类之一。紫贻贝被认为是一个外来种，20世纪50年代的时候仅见过中国北部大连沿海，现在青岛、浙江、福建和广东等地都有分布[4]。据统计，2004年中国贝类产量达到了 71.7万吨，占世界贝类产量的 38.6%[5]。虽然我们不能把不同物种各自的产量区分开来，但有专家认为，紫贻贝大约占到总产量的三分之一。紫贻贝苗种一直以来主要靠自然的野生贝苗，随着紫贻贝养殖产业的发展，对野生苗种的需求不断提高。

在过去的几十年时间里，紫贻贝的研究主要集中于生物学方面，包括细胞生物学[6]、生理学[7]、蛋白质组学[8]。对于贻贝属群体遗传学研究主要是在 20世纪七八十年代，当时电泳技术为遗传学研究提供了非常好的方法。自从 1976年以后，对于贻贝属群体遗传学和分类学研究有了非常大的进展，特别是分布于北美大西洋沿海的贻贝物种。一直以来，中国对于紫贻贝的群体遗传结构还未见报道。本文采用线粒体COI序列分析对中国沿海紫贻贝的群体结构与遗传多样性进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

紫贻贝样本在 2007年 7－9月期间分别从丹东、大连湾、秦皇岛、青岛、温州和宁德沿海的潮间带收集。这些区域紫贻贝养殖苗种主要靠收集野生产卵场的幼体。总共129个样本，固定于无水乙醇保存。这些紫贻贝样本的具体采集时间，数量见表1。

表1 紫贻贝不同群体采样地点、时间和样本数Tab. 1 Sampling localities, time and number of individuals sampled in each population

2.2 DNA 抽提与PCR扩增

采用常规酚-氯仿法从紫贻贝外套膜中提取总DNA，参照沈玉帮等[9]的方法。经 1%琼脂糖电泳对DNA质量进行评价，DNA的浓度运用分光光度计测量DNA溶液的260 nm的吸收值。

用于扩增COI基因片段的引物序列为，上游引物 LCO7490：5’-GGTCAACAAATCATA - 3 ’；下游引物 HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGA- 3’[10]。PCR扩增在eppendorf mastercycle 5333型PCR仪上进行。PCR反应体积为50 µL，其中包括模板DNA 100 ng，各种 dNTP 0.2 mmol·L-1,每个引物浓度为0.2 µmol·L-1，Taq 聚合酶 1U（天根公司），10×缓冲液 5 µL，Mg2+2.0 mmol·L-1，加灭菌双蒸水至 50 µL。每次反应都设不含模板的对照实验. PCR反应条件为：94℃ 预变性3 min，然后进行35个循环，每个循环包括 94℃ 50 s，48℃ 50 s，72℃1 min，最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离。纯化后的PCR产物送往上海生工生物工程有限公司直接进行双向测序反应。

表2 紫贻贝不同取样位点线粒体COI基因单倍型频率Tab. 2 mtDNA haplotypes distribution of M. galloprovincialis populations

2.3 数据分析

将通过双向测序获得的序列进行拼接。拼接好后，在GenBank数据库中进行BLAST同源性搜索，验证发现所获得的序列确实是COI基因，没有受到其它 DNA的污染。运用 BIOEDIT软件（Version 7.0.9）[11]将所有的核苷酸序列翻译成氨基酸，排除由于测序所造成的碱基错误，并进行序列比对，然后再翻译成核苷酸序列用于数据分析，并以Fasta格式保存。DNASP version软件[12]被用来估计每个群体的单倍型多样性（h）[13]和核苷酸多样性（π）[14]。用 ARLEQUIN 软件[15]计算 Tijma’s D[16]和 Fu’s Fs值[17]，用来对各个群体的生物统计史（demographic history）进行估计。另外，错配分布检验（mismatch distribution tests）被用于纠正由于群体突然扩张而形成的无效模型。不同群体间的FST被确定同时也进行了显著性检验。最后，AMOVA分析对群体分化进行了定量。这个统计分析都是用ARLEQUIN软件[15]处理。为了保证结果更加可靠，MODELTEST version3.04软件[18]被用来估计序列，从而选择适合该序列的最佳核苷酸替代突变模型。以厚壳贻贝（Mytilus coruscus）为外群，使用 MEGA4.0[19]软件中邻接法（neighbor-joining method）构建单倍型系统发育树，系统树中各个支点的支持率采用 bootstrap法，重复 1 000次，Bootstrap值大于70被认为是可靠的节点。为了进一步了解紫贻贝的系统地理学史，我们使用了TCS version 1.2软件[20]构建了最短距离网络图（minimum spanning network）。

表3 紫贻贝不同群体单倍型数（N），基因多样性（H），核苷酸多样性（π）Tab. 3 Number of haplotypes (N), gene diversity (H), nucleotide diversity (π) for each population

表4 紫贻贝不同群体之间遗传分化系数FST Tab. 4 Pairwise FST between different populations

3 结 果

3.1 不同群体的遗传多样性

对中国沿海紫贻贝6个群体124个个体的COI基因进行直接测序，删除两端不可靠的序列，选取中间的593 bp进行分析。比对发现变异位点有33个，其中26个是简约信息位点。从124个个体中总共发现了 13个单倍型。碱基组成存在明显的偏向性，A、T、G、C含量分别为35.6%、27.2%、15.2%、22.1%，A+T含量为62.8%，G+C含量为37.3%, 与其它贝类的COI基因序列结果类似[21,22]。

单倍型hap1、hap4和hap5在每个群体中都有分布，但hap1是最多的，占所有个体的56.4%（表2）。单倍型 hap2除了未在青岛群体出现外，其它群体中都有分布。单倍型 hap3除了在大连湾群体中没有分布外，其它群体中都有分布。61.5%的单倍型仅仅在一个群体中发现。青岛群体的单倍型数目是最多的（8），温州群体、丹东群体和宁德群体次之（6）。除了秦皇岛群体外，其它群体都有自己特有的单倍型，这些特有的单倍型可以用来进行群体鉴定。

每个群体的单倍型数、基因多样性和核苷酸多样性见表 3。宁德群体和丹东群体都有较高的单倍型和核苷酸多样性。不同群体单倍型多样性的范围为 0.569～0.821。其中最高的是宁德群体，最低的是秦皇岛群体。而不同群体核苷酸多样性的范围是0.014 1～0.017 8。最高的是宁德群体，秦皇岛群体最低。

表5 紫贻贝线粒体COI序列分子方差分级分析Tab. 5 AMOVA analysis of all sequences of mtDNA COI gene

2种不同的中性检验法被用来对紫贻贝不同群体受到选择作用的影响进行检测（表3）。Fu’s Fs 检验主要用于检验群体扩张, 本研究中所有群体的Fu’s Fs 都是正值，而且都是不显著的，说明在紫贻贝所有群体中，中性进化的无效假设不能被拒绝。Tajima’D检验是通过计算分离位点数与核苷酸差异的平均值之间的产值来获得。从表3可以看出，紫贻贝任一群体的Tajima’D都是正值，而且没有出现显著不等于 0，说明可以用中性突变假说来解释紫贻贝线粒体COI基因的多态性，与Fu’s Fs 检验结果是相同的。错配分布检验发现，除了青岛群体和大连湾群体外，群体的突然扩张没有出现在其它的4个群体中（P＜0.05）。

3.2 紫贻贝群体遗传结构

AIC(Akaike information criterion) 分析表明Tamura-Nei是最佳核苷酸替代突变模型。使用MEGA4.0软件，以厚壳贻贝为外群，对紫贻贝13个单倍型建立了 NJ树。紫贻贝单倍型被聚成了 4个不同的具有高支持率的分枝,分别是A、B、C、D（图1）。分枝A节点的bootstrap值是74%，分枝B的bootstrap值是65%，分枝C的bootstrap值是71%，分枝D的bootstrap值是99%。分枝A、B、C、D分别包括了3，3，3，4个单倍型。分枝A、B、C中的单倍型来自全部的6个群体，分枝D中的单倍型来自于 4个群体（QD、DLW、DD）。对于不同的单倍型也做了网状分析，但是 13个单倍型没有显示清楚的网状结构。

运用分子方差变异（AMOVA）和固定指数FST对遗传结构加以验证。不同群体间FST的结果见表4。所有 6个紫贻贝群体之间都没有发生显著遗传分化，FST值从0.008 9到0.050 9（P＞0.05），最大的遗传分化存在于宁德群体与青岛群体之间。分子方差变异分析表明：98.91%的变异存在于群体内，而群体间的遗传变异为1.09%（表5）。

4 讨 论

4.1 紫贻贝群体的遗传多样性分析

对于群体遗传学、系统发育学、分类学、进化遗传学等遗传学研究来说，许多生物的遗传多样性分析是非常必要的[23]，它是形成生物多样性的基础，也是物种进化潜能的保证。本研究主要是对中国沿海6个紫贻贝群体的线粒体COI基因片段序列的多态性进行分析。所获得的结果与其它海水贝类同一基因序列的结果[24-26]相比，在单倍型数、基因多样性和核苷酸多样性上，具有较低的遗传多样性。在伊比利亚半岛采用同工酶[27]、线粒体[28]、微卫星[30]的方法发现紫贻贝具有高的遗传多样性。而对于中国沿海的紫贻贝遗传多样性研究的未见其它报道。从南到北紫贻贝群体的遗传多样性不高，所有被研究群体间共有单倍型较多（表2），进而说明了紫贻贝引进到中国的时间不长，关于紫贻贝类似的情况在南非也被发现[31]。同时，我们所选择采样区都具有非常大的紫贻贝群体，因为这些区域都是我国主要的紫贻贝养殖区域，结果表明大的群体并不代表较高的遗传多样性，可能是由于贝类具有高繁殖力和较强的抗逆性，即使在海洋环境条件很恶劣的条件下，还可以继续存活。

图1 紫贻贝线粒体COI基因不同单倍型邻接树Fig. 1 Neighbor-joining tree based on mtDNA COI sequences

据记载，紫贻贝在中国沿海最先被发现于北方大连沿海[4]。紫贻贝群体并没有出现从北方到南方逐步降低的情形，而是宁德和丹东群体具有略高的遗传多样性，其他4个群体的遗传多样性相对较低，可能是由以下3个因素中的一个或者是多个因素影响的。像大连湾群体，遗传多样性低可能是由奠基效应引起的。青岛群体可能只是人为或者是无意识地如运输船等从其它地方带来的少量个体后形成的。另一个原因可能是过度采捕导致的。辽宁每年紫贻贝产量非常大。除了鲜活食用外，还制成罐头、贻贝油和干制品淡菜等美味食品。大连湾群体也有可能是由此原因引起的。第三个原因可能是采集样本量少。Diz和Presa运用微卫星标记研究西班牙紫贻贝遗传多样性时就发现大样本与等位基因多样性是有关系的[32]。

4.2 紫贻贝群体遗传结构

紫贻贝是一种适应性非常强的物种，很容易适应各种各样的环境因素，包括温度[33]，因此在世界上好多地方被无意地引入，并且形成了种群，包括日本、南非、加利福尼亚和智利[34]。 在中国，据王祯瑞记载，紫贻贝是一种外来种。中国紫贻贝来自于哪里，到现在还未有记载。

FST常用来表示2个群体之间的分化程度，在0～1的范围内，FST值越大表示两个群体的分化程度越高。本研究中，不同群体之间FST的范围为0.008 9～0.050 9（表4），说明紫贻贝群体之间的遗传差异非常小。所有群体之间的种群分化都很小，并且不显著。这可能是由于各群体还没有经过足够长的时间和完全的地理隔离来累积足够多的特有的突变[35]，例如各群体之间频繁的基因流。从 NJ法建立的系统树来看这 6个紫贻贝群体也没有完全分开,而是不同群体的单倍型错乱交织在一起。从分子方差分析（AMOVA）来看，基本上全部的变异都是存在群体内（表5），与FST的结果是一致的。

在中国紫贻贝的遗传结构非常小，在沿海发现也只是在 20世纪四五十年代，可能是由于时间短的缘故，还未形成明显的群体遗传分化[36]。但是紫贻贝在世界各海域被认为是一种适应性很强的贝类，从中国的情况也进一步可以说明。从丹东到宁德二千多公里的范围，都有紫贻贝的存在，可能是由于紫贻贝幼体在早期发育阶段处于浮游状态的缘故[37]，因为这段时期是紫贻贝群体栖息地向周围延伸的主要时期。另外也有可能是人为的有意引入，像宁德地区,经常从大连采购苗种到当地进行养殖，或者是无意识的带入如船。

[1] Levin S A, Grenfell B, Hastings A, et al. Mathematical and computational challenges in population biology and ecosystem science [J]. Science, 1997, 275： 334-343.

[2] Tudela S, Garca-Marn J L, Pla C. Genetic structure of the European anchovy, Engraulis encrasicolus, in the northwest Mediterranean[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 1999,234： 95-109.

[3] Gosling EM. The Mussel Mytilus： Ecology, Physiology, Genetics and Aquaculture [M]. Amsterdam： Elsevier Science Publication,1992.

[4] 王祯瑞. 中国动物志：软体动物门，双壳纲，贻贝目 [M]. 北京：科学出版社, 1997.

[5] 农业部渔业局. 中国渔业年鉴 [M]. 北京： 中国农业出版社,2005.

[6] 王琼, 童裳亮. 贻贝核型及染色体带型分析 [J]. 动物学报, 1994,40(3)： 309-316.

[7] Labarta U, Fernandez-Reiriz M J, Babarro J M F. Difference in physiological energetics between intertidal and raft cultivated mussels Mytilus galloprovincialis [J]. Marine Ecology Program Series, 1997,152： 171-173.

[8] Lopez J L, Mosquera E, Fuentes J, et al. Two dimensional gel electrophoresis of Mytilus galloprovincialis. Differences of protein expression between intertidal and cultured mussels [J]. Marine Ecology Program Series, 2001, 224： 149-156.

[9] 沈玉帮，李家乐，牟月军. 厚壳贻贝与贻贝遗传渐渗的分子生物学鉴定 [J]. 海洋渔业, 2006, 28(3)： 195-200.

[10] Folmer O, Black M, Hoeh W. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates [J]. Molecular Marine Biology and Biotechnology, 1994, 3(5)： 294-299.

[11] Hall T A. BioEdit： A user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT [J]. Nucleic Acids Symposium Series, 1999, 41： 95-98.

[12] Rozas J, Sanchez-De I, Barrio J C, et al. DnaSP, DNA polymorphi--sm analyses by the coalescent and other methods [J]. Bioinformati--cs, 2003, 19： 2496-2497.

[13] Tajima F, Nei M. Estimation of evolutionary distance between nucleotide sequences [J]. Molecular Biology and Evolution, 1984, 1：269-285.

[14] Nei M. Molecular Evolutionary Genetics [M]. New York： Columbia University Press, 1987.

[15] Excoffier L, Laval G, Schneider S. ARLEQUIN version 3.0： an integrated software package for population genetics data analysis[J]. Evolutionary Bioinformatics Online, 2005, 1：47-50.

[16] Tajima F. Statistical method for testing for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism [J]. Genetics, 1989,123： 585-595.

[17] Fu Y X. Statistical tests of neutrality against population growth,hitchhiking and background selection [J]. Genetics, 1997, 147：915-925.

[18] Posada D. Modeltest Server： a web-based tool for the statistical selection of models of nucleotide substitution online [J]. Nucleic Acids Research, 2006, 34：700-703.

[19] Tamura K, Dudley J, Nei M, et al. MEGA4： Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 [J]. Molecular Biology and Evolution, 2007, 24(8)： 1596-1599.

[20] Clement M, Posada D, Crandall K A. TCS：a computer program to estimate gene genealogies [J]. Molecular ecology, 2000, 9：1657-1659.

[21] 陈爱辉, 李朝霞, 封功能. 基于线粒体 COI基因序列的文蛤属（软体动物们：帘蛤科）系统发育关系 [J]. 动物学研究, 2009,30(3)： 233-239.

[22] 李咏梅，陈秀荔，彭敏, 等. 基于线粒体COI基因序列探讨广州钦州湾牡蛎的遗传分化 [J]. 西北农林科技大学学报（自然科学版），2009, 37(3)： 60-65.

[23] Avise J C. Molecular markers, natural history and evolution [M].San Franciso： Chapman and Hall, 1994.

[24] Stepien C A, Morton B, Dabrowska K A. Genetic diversity and evolutionary relationships of the troglodytic ‘living fossil’ Congeria kusceri (Bivalvia： Dreissenidae) [J]. Molecular Ecology, 2001,10(8)： 1873-1879.

[25] Kocuzius M, Nuryanto A. Strong genetic population structure in the boring giant clam, Tridacna crocea, across the Indo-Malay Archipelago： implications related to evolutionary processes and connectivity [J]. Molecular ecology, 2008, 17： 3775-3787.

[26] 沈玉帮, 李家乐, 冯冰冰. 厚壳贻贝养殖群体与野生群体线粒体DNA的遗传分析 [J]. 动物学研究，2009, 30(3)： 240-246.

[27] Quesada H, Zapata C, Alvarez G. A multilocus allozyme disconti--nuety in the mussel Mytilus galloprovincialis： the interaction of ecological and life-history factors [J]. Marine ecology progress series, 1995, 116： 99-115.

[28] Quesada H, Beynon C M, Skibinski D O F. A mitochondrial DNA discontinuity in the mussel Mytilus galloprovincialis Lmk：Pleistocene vicariance biogeography and secondary intergradations[J]. Molecular biology and evolution, 1995, 12： 521-524.

[29] Diz A P, Presa P. Regional pattern of microsatellite variation of Mytilus galloprovincialis from the Iberian peninsula [J]. Marine biology, 2008, 154：277-286.

[30] Zardi G I, Mcquaid C D, Teske P R, et al. Unexpected genetic structure of mussel populations in south African： indigenous Perna perna and invasive Mytilus galloprovincialis [J]. Marine ecology progress series. 2007, 337：135-144.

[31] Diz A P, Presa P. The genetic diversity pattern of Mytilus galloprovincialis in Galician Rias(NW Iberian estuaries) [J].Aquaculture, 2009, 287： 278-285.

[32] Branch G M, Steffani C N. Can we predict the effects of alien species? A case-history of the invasion of South Africa by Mytilus galloprovincialis (Lamarck) [J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2004, 300： 189-215

[33] Daguin C, Borsa P. Genetic relationships of Mytilus gall--oprovincialis Lmk. populations worldwide： evidence from nuclear-DNA markers [J]. Geological Society, London, Special Publications, 2000, 177： 389-397.

[34] Sugaya T, Sato M, Yokoyama E, et al. Population genetic structure and variability of pacific herring clupea pallasii in the stocking area along the pacific coast of northern Japan [J]. Fisheries science, 2008,74： 579-588.

[35] Whitock M C, David E M. Indirect measures of gene flow and migration： FST≠1/(4Nm+1) [J]. Heredity, 1999, 82： 117-125.

[36] Lutz R A, Kennish M J. Ecology and morphology of larval and early larval postlarval mussel [M]. Amsterdam： Elsevier Science Publication, 1992.

Genetic diversity of blue mussel Mytilus galloprovincialis in China based on sequence analyses of mitochondrial COI gene

SHEN Yu-bang, ZHANG Jun-bin, FENG Bing-bing, LI Jia-le

（Key laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Ministry of Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China）

Genetic biodiversity of Mytilus galloprovincialis was estimated, based on sequence analyses of the mitochondrial cytochrome oxidase Ⅰ(mtDNA COI) gene, employing 124 individuals of 6 groups along the coast of eastern and southern china. 13 haplotypes and 33 variation sites were observed in the sequences of the 124 individuals.QD population had the greatest number of haplotypes, while secondary for WZ population, DD population and ND population. Among all six populations, gene diversities ranged from 0.569 to 0.821, and the nucleotide diversities from 0.0155 to 0.0510, suggesting that M. galloprovincialis has low genetic diversity. The pairwise estimates of FSTbetween M. galloprovincialis populations were small, and no significant genetic differentiation was observed between populations. AMOVA analysis showed that a large proportion of variation was attributed within population of M.galloprovincialis. This study provides objective data for the sustainable exploitation and fishery management of M.galloprovincialis.

Mytilus galloprovincialis; mtDNA COI; genetic diversity

A

1001-6932(2011)04-0435-06

2010-04-03；

2011-04-02

上海市重点学科建设项目（Y1101）；上海市优青项目（B81010615）。

沈玉帮（1981－），男，江苏盐城人，博士研究生，专业方向为水产动物种质资源与种苗工程。E-mail：ybshen1981@126.com。

李家乐，教授，主要从事水产动物种质资源与遗传育种研究。E-mail：jlli2009@126.com。