间充质干细胞的衰老与系统性红斑狼疮的研究进展

戴 林，姜津霞(综述)，曹晓蕾，顾志峰(审校)

(1.南通大学附属医院风湿免疫科，江苏南通226001;2.南通大学医学院病理教研室，江苏南通226001)

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有体外高度扩增、多向分化、支持造血、免疫调节及诱导免疫耐受能力的多能干细胞。其组织器官的维持和再生作用越来越成为研究的热点。但是，由于培养代数的增多及疾病的原因，MSCs会逐渐出现衰老。MSCs的衰老与疾病之间的关系日益受到重视。但MSCs的衰老及机制目前尚未完全明了。现就MSCs衰老的研究进展及与系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)的关系予以综述。

1 MSCs的生物学特性及免疫学特性

MSCs来源广泛，可来源于骨髓、肺脏等多种组织器官，体外具有很强的扩增能力，且仍然保持稳定的表型和多向分化的潜能。MSCs表面标志白细胞分化抗原、基质细胞抗原阳性，造血谱系标记阴性。目前认为 MSCs标志物 CD166、CD105、CD44等标记阳性，CD34、CD45、CD14等造血谱系标记阴性，结合 MSCs向骨、脂肪、软骨等分化及贴壁生长的特性可以判断为 MSCs［1，2］。

MSCs具有诱导免疫耐受和免疫抑制的特性。研究表明［3］，干扰素γ可上调主要组织相容性抗原复合物Ⅰ类分子表达，并可诱导主要组织相容性抗原复合物Ⅱ类分子的表达，而不改变协同刺激分子的表达。MSCs由于缺乏协同刺激分子不能产生第二信号，将导致T淋巴细胞无能，从而可诱导免疫耐受。即使加入干扰素γ诱导了主要组织相容性抗原复合物Ⅱ类分子的表达，也不能刺激同种异体反应，说明MSCs无免疫原性，能诱导免疫耐受。

MSCs能抑制混合淋巴细胞反应中的T细胞增殖，包括同种异基因抗原和丝裂原引起的T细胞增殖，且这种抑制作用不受主要组织相容性抗原复合物限制。MSCs可在体外抑制细胞毒性淋巴细胞的产生，并可逃避细胞毒性淋巴细胞和自然杀伤细胞的杀伤作用。MSCs可延长异体皮肤移植存活率。肿瘤细胞植入异体小鼠时，肿瘤细胞会被宿主免疫系统清除，当肿瘤细胞和MSCs同时注入异体小鼠后，肿瘤细胞可在受体内存活，表明MSCs在体内外具有免疫抑制功能。

2 MSCs衰老的改变及特征

衰老的细胞往往表现为细胞周期抑制蛋白(如p53/p21、p16/Rb蛋白)的表达上调、不可逆的G1期生长停滞、细胞体积增大、衰老相关的β-半乳糖苷酶(senescence associated β-galactosidas，SA-β-Gal)活性增加、分化能力异常。

Sethe等［4］认为衰老的 MSCs往往具有以下改变:①扩增速度减慢，数量减少;②分化能力、再生能力等功能改变;③迁移能力改变。

衰老的MSCs往往具有以下特征:①细胞体积增大、肌动蛋白应力纤维改变;②细胞集落数下降、细胞的增殖潜能改变;③分化能力的改变;④生长曲线变慢;⑤端粒、端粒酶活性改变;⑥SA-β-Gal活性增加;⑦超微结构改变;⑧分泌细胞因子异常;⑨调节细胞生物学行为(如细胞周期、DNA损伤后修复及有丝分裂等)相关基因的表达变化［4，5］。

2.1 衰老MSCs的形态 研究表明［6］，衰老的MSCs体积增大、细胞扁平、核变大;纤维状梭形细胞的比例逐渐减少，而多角形、星形细胞的比例增加;触角增多，胞质变多而且充满细小的颗粒甚至空泡，折光度差，黏附能力增加。衰老的MSCs含有肌动蛋白应力纤维增多。老年人MSCs在体外培养时，纺锤体型MSCs数目减少。MSCs转染了肉瘤病毒40或人端粒酶反转录酶后，细胞表现为永生化，体积较转染前明显减少。这也提示衰老MSCs体积增大。

2.2 衰老MSCs的增殖潜能 细胞在体外培养中的传代次数反映了细胞的增殖能力。研究表明，老龄鼠骨髓MSCs成纤维细胞集落生成单位形成减少。Baxter等［7］研究表明，MSCs的增殖能力随着年龄的增加而下降，取自年老个体的MSCs在体外传代的次数明显低于年轻个体。但也有一些研究未发现类似的变化。这些研究差异可能与MSCs的培养环境有关。

2.3 衰老MSCs的分化能力 目前有关衰老MSCs的分化研究大多集中在向成骨和脂肪分化能力的研究。研究表明［4］，衰老MSCs向成骨细胞分化的百分率随着年龄的增加而下降，提示向成骨分化总体能力的降低。Bonab等［8］的研究显示，骨髓MSCs向脂肪转化的能力随着年龄的增加而增强。有学者将这种成骨转化能力的减低和脂肪转换能力的增强称之为脂肪转换，但该研究结果存在一定争议。Shi等［9］研究不同年龄段兔的脂肪MSCs的成骨分化能力，未发现在成骨细胞分化方面存在差异。Muraglia等［10］通过对185例骨髓MSCs进行分化研究，发现MSCs的单项分化能力并不存在年龄差异，但是年轻供体MSCs的双向或者三向分化能力要强于年老者。这也提示，随着年龄的增加骨髓MSCs的分化潜能确有某种程度或某个方面的减弱。然而，该研究并未发现MSCs的脂肪分化能力随着增龄而增加。Park等［11］的研究提示，MSCs的脂肪分化能力下降与细胞的小窝蛋白1表达增加有关。但总的研究表明，随着MSCs的衰老，MSCs的分化潜能有下降趋势。

2.4 衰老MSCs的生长曲线 由于接种密度的不同，MSCs分裂成双倍细胞的时间为 12～24 h。Baxter等［7］研究表明，老年个体来源的 MSCs生长速率较来源于年轻个体的MSCs明显下降。

2.5 衰老MSCs的端粒及端粒酶 当端粒到达一定长度时，细胞停止分裂进入细胞衰老。Baxter等［7］研究表明，MSCs以每年17 bp的速率缩短，在体外培养时，端粒长度的缩短速率为每世代缩短30～120 bp，但是其他的研究小组存在不同的结论。

研究表明［12］，端粒酶的活性与 MSCs的分化功能相关。肿瘤细胞、胚胎细胞、胚胎干细胞、造血干细胞等干细胞的端粒酶处于活化状态，体细胞端粒酶则处于失活状态。有关MSCs是否表达端粒酶还存在一定争议。这可能与端粒酶的测定方法和不同的判定标准有关。有学者认为表达端粒酶活性的MSCs可能是 MSCs的一个亚型。Shi等［13］研究表明，端粒酶的持续表达能促进MSCs细胞寿命的延长及分化能力的增强。Liu等［14］研究发现，端粒酶剔除的小鼠MSCs显示早衰的征象。

2.6 衰老 MSCs 中 SA-β-Gal的表达 SA-β-Gal是衰老细胞的标志酶，体外培养的人二倍体成纤维细胞SA-β-Gal染色阳性率随代龄增加而增加，老年皮肤SA-β-Gal染色阳性率高于年轻个体，提示SA-β-Gal是体内外细胞衰老研究的标志。Vacanti等［15］研究发现，猪MSCs随着培养代数的增多，SA-β-Gal表达增加。该研究的类似结果被Park等［11］在人MSCs中加以证实，并伴有p53和p16/Rb表达的增加。Stenderup 等［16］研究发现，SA-β-Gal活性在末代培养的MSCs表达明显增加，但在不同年龄供体的MSCs中未发现SA-β-Gal活性表达的差异与年龄相关。

2.7 衰老MSCs分泌细胞因子的异常 衰老相关的功能改变还包括分泌激酶、细胞因子、生长因子的变化，从而通过调节组织微环境而改变组织功能。Moerman等［17］研究表明，年老供体MSCs分泌转化生长因子 β(transforming growth factor β，TGF-β)的能力下降。Tsuboi等［18］在早衰鼠MSCs的研究中也发现类似结果。骨形成蛋白2/4对于成骨细胞的成熟具有十分重要的作用。研究表明，衰老 MSCs分泌TGF-β、骨形成蛋白2/4的能力下降，这可能与向成脂肪转化有关［17］。白细胞介素6能够促进细胞增殖、分化，在炎性急性反应时相起着十分重要的作用。白细胞介素6的分泌能力随着MSCs供体年龄的增加而增加［19］。

2.8 调节细胞生物学行为相关基因在衰老MSCs的表达 研究表明［20］，端粒依赖机制的细胞衰老，往往是由细胞周期相关蛋白p53和它的下游p21cip1所触发。p16INK4A对细胞的衰老也具有十分重要的作用。在不利于细胞生长的环境下，p16INK4A在细胞衰老过程中起到十分重要的作用。定量分析MSCs的细胞周期抑制蛋白发现，衰老的 MSCs往往伴随着p16INK4A、p53、p21cip1的高表达［15］。Shibata 等［21］研究表明，衰老MSCs高表达p16INK4A，但不高表达p53和p21cip1，这也提示p16INK4A在MSCs衰老过程中起主导作用。衰老MSCs高表达p16INK4A，且与SA-β-Gal活性呈正相关，与Kit67呈负相关。运用小干扰RAN转染衰老MSCs的p16INK4A表达，能促进细胞增殖，逆转MSCs衰老。转染人端粒酶反转录酶后，MSCs不表达p16INK4A，细胞出现永生化，这也提示p16INK4A在细胞衰老中起十分重要的作用。

近年来，细胞外基质信号调节激酶、细胞外调节蛋白激酶1/2通道引起研究者的重视。当MSCs、MSCs增殖负性调节因子和肝细胞生长因子共培养时，细胞外调节蛋白激酶1/2活性明显增强。p38丝裂原活化蛋白激酶通道参与该过程［22］。研究表明［23］，细胞外调节蛋白激酶1/2信号通道在体外也参与了MSCs的增殖。当细胞与细胞外调节蛋白激酶1/2通道抑制剂PD98059共培养时，能抑制MSCs的增殖作用。

TGF-β的β1、β2两个亚单位具有抑制细胞增殖的作用［24］。研究表明［25］，衰老 MSCs 的 TGF-β1、TGF-β2及 TGF-β 受体 1 mRNA 高表达。但 TGF-β3及其他受体的表达未变。Smad蛋白信号通道参与了该过程。外源性 TGF-β1、TGF-β2与 MSCs共培养时能促进p16INK4A和p53-p21cip1通道的活化。

2.9 影响MSCs增殖的因素 MSCs增殖能力受供体的年龄、培养的密度、培养基成分、细胞因子的水平等多种因素的影响［5］。活体组织衰老与体外复制性衰老一致性存在很多争议。但目前较为一致的观点是体细胞的增殖能力与供体的年龄存在负相关。Shitata等［21］研究表明，来源于年老供体的 MSCs培养代数大约是年轻供体的1/4。MSCs形成细胞集落数随着供体年龄的增加而下降。成体组织来源的MSCs的扩张能力较胚胎组织明显减弱［26］。来源于老年个体的 MSCs表现为衰老征象［7］，SA-β-Gal阳性数目显著增加，这提示供体的衰老能导致MSCs的衰老［27］。但也有一些研究表明［28］，供体年龄、增殖速率、细胞复制寿命与SA-β-Gal活性之间并不存在相关性。

3 MSCs衰老与SLE的关系

SLE是一种自身免疫异常、多器官受累的全身性疾病。研究表明［29］，SLE是一种MSCs异常性疾病。SLE患者MSCs存在异常，异基因来源的MSCs移植可有效治疗SLE患者及动物模型。Papadaki等［30］研究表明SLE患者骨髓MSCs不能正常支持造血。SLE患者的骨髓MSCs体外培养传代明显低于正常人，细胞因子白细胞介素7等表达异常，向成骨细胞及脂肪细胞分化能力减弱［31］。SLE患者MSCs超微结构可见大量自噬体和细胞骨架异常［32］。最近Nie等［33］报道SLE患者骨髓MSCs生长缓慢，这提示SLE患者骨髓MSCs可能是一种衰老的MSCs。最近研究结果初步表明，正常骨髓MSCs与SLE患者骨髓MSCs细胞周期相关蛋白表达存在差异，p16INK4A在SLE患者骨髓MSCs表达明显增高，其相互作用的细胞周期素依赖性蛋白激酶4/6表达显著下降、p-Rb表达降低，骨髓MSCs呈现显著的周期抑制，细胞停滞在G0/G1期。然而通过siRNA干扰SLE患者骨髓MSCs p16INK4A的表达后，可以逆转 SLE患者骨髓MSCs的衰老特征。这提示细胞周期相关蛋白可能参与了SLE患者骨髓 MSCs的衰老过程，并影响MSCs的功能。

4 结语

MSCs由于具有多向分化、免疫抑制、诱导免疫耐受及在体外能大量扩增的能力，所以越来越受到学者们的重视，在细胞治疗领域具有广阔的应用前景。目前研究表明MSCs在自身免疫性疾病，尤其是SLE的发生、发展中具有十分重要的作用。遗传因素及体内环境因素导致MSCs的衰老进而影响MSCs的功能和作用。因此对SLE患者MSCs的衰老研究具有十分重要的意义。

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