DNA甲基化与结直肠癌

文 玉（综述），李晓燕（审校）

（昆明医学院第一附属医院消化内科，昆明 650032）

结直肠癌是较为常见的恶性肿瘤，发病率呈逐年上升趋势。据统计，世界范围内2007年新增结直肠癌病例数为120万，当年因结直肠癌致死人数达60万［1］。在美国，2010年可能约有569 490人死于癌症，即每日约有1500人死于癌症;男性和女性的肿瘤患者在结直肠癌的发病率和病死率均位列第三位［2，3］。结直肠癌在中国也是最常见的恶性肿瘤之一。结直肠癌发病率居高不下的原因之一就是缺乏行之有效的早期检测方法。随着表观遗传学的发展，DNA甲基化与肿瘤的关系是目前研究的热点。肿瘤的发生及发展中存在一系列甲基化水平的改变，因此，对于某些特异性的异常甲基化的检测，可成为早期诊断肿瘤的特异分子指标。

1 DNA甲基化与表观遗传学

表观遗传学的概念是1942年由Waddington提出的。表观遗传学是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变。换言之，这种可遗传的变化是指细胞内除可遗传信息外的其他可遗传物质的改变，且这种改变在发育和细胞增殖中能稳定地传递下去，如DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和RNA干扰等。表观遗传学是从DNA水平、蛋白质水平、染色质水平及RNA水平等多个水平调控基因的表达［4］，而上述几个水平之间是相互关联的。

DNA甲基化是目前研究最多、最清楚的一种原核和真核生物普遍存在的表观遗传学调控机制。DNA甲基化一般与基因的沉默相关，非甲基化则一般与基因的活化相关，而去甲基化往往是与一个沉默基因的重新激活相关［5］。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下，将作为甲基供体的S-腺苷甲硫氨酸结合到胞嘧啶5位碳原子上，生成5-甲基胞嘧啶的过程［6］。研究表明，DNA甲基化是抑制基因活性的一个重要机制，DNA甲基化是从碱基突变、抑制转录水平基因表达及染色体的不稳定性等方面影响基因表达，而转录水平抑制基因表达的作用目前研究得较多。

DNA甲基化抑制基因转录的机制有:①DNA的胞嘧啶发生甲基化后，DNA的空间构象发生改变，从而影响了转录因子与DNA的结合;②甲基化的DNA与 CpG结合蛋白（methyl-CpG binding proteins，MeCPs）结合，改变了染色质的结构，从而抑制了基因的转录;③序列特异性甲基化连接蛋白与启动子区甲基化CpG岛结合，组织转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响了基因的转录［7］。

DNMT在甲基化中的作用也不容忽视。目前所知的DNMT有3类（5种），分别是 DNMT1、DNMT2和 DNMT3（DNMT3a、DNMT3b 和 DNMT3L）。DNMT1主要维持甲基化状态，是非CpG位点从头甲基化所必需，并参与甲基化状态的延伸，即是复制后维持甲基化的关键酶［8］。目前对于DNMT2的认识尚少，DNMT2在组织内主要分布于肌肉、发育中的胚胎内脏、卵巢囊肿及增殖中的睾丸细胞［9］，研究认为其DNA甲基化酶活性非常弱，且识别位点并非CpG，因此在体外实验中常常难以观测到其DNA甲基化酶 活 性［10］。DNMT3 包 括 DNMT3a、DNMT3b 和DNMT3L，主要参与从头甲基化，是从头甲基化酶，对CpG位点的侧翼序列有一定的倾向性，研究显示其3种亚型间具有相互影响及协同作用［11，12］。

2 结直肠癌中的DNA甲基化改变

正常的DNA甲基化对于维持机体的功能是必需的，如基因印迹、X染色体失活、细胞分化和胚胎发育等［12］，而异常的DNA甲基化则会引发疾病甚至肿瘤的发生，异常CpG的重新甲基化常被认为是人类肿瘤发生的一个早期特征［13］。结直肠癌中，基因不稳定性主要分为:微卫星不稳定、CpG岛甲基化表型和癌基因突变［14］。而DNA甲基化多表现为甲基化水平降低（包括整个基因组的广泛低甲基化、癌基因的低甲基化及未甲基化CpG岛的重新甲基化）和某些特定区域发生的高甲基化（即区域性高甲基化）。

2.1 低甲基化 低甲基化通过以下途径诱发肿瘤:①低甲基化诱导产生内源性反转录病毒物质，这些物质可插入激活原癌基因;②低甲基化可通过表观遗传效应激活原癌基因;③低甲基化可导致基因组不稳定性。有研究表明，在许多肿瘤中，细胞整体呈现低甲基化水平，随着病情的恶化，低甲基化程度则会逐渐加强［13］。

2.2 高甲基化 区域性高甲基化发生的特定区域一般为跨越管家基因和肿瘤抑制基因启动子的CpG岛区，由于其能诱导基因编码区突变或使基因失活而利于肿瘤的发展。目前已经鉴定出的在不同肿瘤中易发生高甲基化的基因包括参与细胞周期调控、信号转导通路、凋亡、DNA错配修复、血管生成抑制、肿瘤转移及浸润、耐药性形成等基因。而这种基因水平的改变与基因剔除和基因突变等不同，可以被DNMT抑制因子逆转，从而恢复正常甲基化状态［15］。

2.3 结直肠癌中甲基化异常的基因 1999年，Toyota等［16］在结直肠癌中发现了一组高甲基化聚集的特殊CpG岛甲基化表型，是多个基因同时发生转录失活，引起基因外不稳定的一种通路，在结直肠癌形成的后期起着重要作用。一系列研究表明，结直肠癌中的5-甲基胞嘧啶较正常组织水平低，而对于p16（即 MTS，multiple tumor suppressor 1）、错配修复基因 1（human mutL homolog 1，hMLH1）和 MINT（Msx2 interacting nuclear target protein）位点甲基化水平的检测发现，其广泛低甲基化主要发生于结直肠癌早期。广泛低甲基化可以增加某些基因的表达水平，如癌基因c-myc、K-ras以及结直肠癌中S100钙调蛋白 A4 基因等［17］。Liu 等［18］报道，在 78% 的结直肠癌组织中和13%的癌旁组织中检测出A激酶锚定蛋白 12（A-kinase anchoring protein12，AKAP12）启动子的甲基化，而近来的一些研究表明，在收集到的结直肠癌患者和正常人血液中检测出 AKAP12，各占48%和8%［19］。Okada 等［20］研究认为，在结直肠癌中TWIST1（twist homolog 1）基因超甲基化是较为常见的，而且它的高表达会进一步造成结直肠癌的恶化。

3 DNA甲基化与结直肠癌早期诊断、检测及治疗

3.1 结直肠癌早期诊断 提高结直肠癌的早期诊断率可以明显改善临床整体治疗效果，对于患者预后具有重要意义。很多CpG岛甲基化事件已成为肿瘤早期诊断的分子靶标，而CpG岛超甲基化可能会是一个很有前景的早期诊断肿瘤的指标。Esteller等［21］报道，在48例平坦型结直肠癌患者中的39例检测到RAS相关区域家族1A基因（Ras association domain family 1A gene，RASSF1A）的启动子超甲基化，结果显示RASSF1A的启动子超甲基化是一个在平坦型结直肠癌发病早期的频发分子事件，并且随后一系列RAS基因（Ras gene）转导路径的异常与平坦型结直肠癌的形态和侵袭性有关。Nishio等［22］认为，人类Runt相关转录因子3（human runt related transcription factor 3，RUNX3）可作为诊断结直肠癌的一种新的血清标志物。Liu等［23］也发现鼻咽癌细胞相关基因6（nasopharyngeal carcinoma associated gene 6，NGX6）介导的启动子甲基化是一个潜在的结直肠癌分子标志。Model等［24］运用微阵列分析和反转录-聚合酶链反应分析等技术，筛选出高度甲基化结直肠癌序列，其中的TMEFF2基因（transmembrane protein with EGF-like and two follistatin domain gene）、表皮生长因子受体基因和ZDHHC22基因（zinc finger，DHHC domain containing 22）等标志物具有高度特异性，并且可用于检测血液或粪便样本，可作为结直肠癌的非侵入性诊断方法［24］。deVos等［25］指出，检测血浆中的SEPT9基因（septin 9 gene）可用于诊断结直肠癌，而Huang等［26］在结直肠癌患者粪便标本中检测出分泌型卷曲相关蛋白2的超甲基化，认为其可作为早期诊断结直肠癌的一种方法［26］。随着深入研究，DNA甲基化将会在结直肠癌早期诊断中发挥重要作用。

3.2 DNA甲基化的检测方法 检测DNA甲基化的主要途径有:①用于甲基化敏感的限制性内切酶来鉴别是否甲基化;②因亚硫酸氢钠可转换未甲基化的胞嘧啶为尿嘧啶，故可用亚硫酸氢钠处理DNA，则发生甲基化DNA的胞嘧啶将不被替代。主要的实验方法有:甲基化敏感的限制性内切酶联用Southern印迹杂交（Southern blotting）、限制性内切酶消化后进行聚合酶链反应、亚硫酸氢钠处理DNA后测序、甲基化特异聚合酶链反应、甲基化敏感单核苷酸引物延长法和亚硫酸氢钠联合限制性内切酶分析法等。

3.3 DNA甲基化与结直肠癌的治疗 DNA甲基化是可逆的动力学过程，因此，抑制DNMT成为治疗肿瘤的一种研究思路，使用DNMT抑制剂，可使肿瘤中甲基化的基因被重新激活［27］。Xiong 等［28］报道，DNMT的作用机制在于通过酪氨酸蛋白激酶/信号转导和转录活化因子3/信号转导和转录活化因子5等信号通路诱导结直肠癌细胞停滞于细胞周期的G2期，继而发生凋亡，从而抑制了肿瘤细胞的生长。Deng等［29］用5-脱氧氮胞苷处理结直肠癌的LoVo细胞株，发现其可重新激活RUNX3的表达而进一步导致肿瘤细胞的凋亡。Hiraki等［30］研究发现，BNIP3基因（BCL2/adenovirus E1B 19 kDa interacting protein 3）的CpG岛甲基化表型可以用于评价联合运用替吉奥胶囊（S-1）和盐酸伊立替康（CPT-11）治疗结直肠癌患者的疗效。

4 结语

随着基因组测序的完成，表观基因组学将成为一个全球性研究热点。结直肠癌的病因及发病机制复杂，而深入研究结直肠癌DNA甲基化模式可从另一角度反映其基因表达状态，解释肿瘤的形成和发展机制，对早期诊断及治疗提供新的思路。近年来，在DNA甲基化与结直肠癌的关系方面的研究也取得了较多的成果，并随之出现了很多敏感的检测甲基化的方法和手段，使得DNA甲基化标志物在临床的应用成为可能，而且以表观遗传改变为靶标的治疗有望在不久的将来用于临床，为结直肠癌的分子治疗提供广阔的前景。

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