肾小球足细胞功能认识的进展

邹 琦(综述)，郑祥雄(审校)

(福建医科大学附属协和临床医学院肾内科，福州350001)

足细胞是高度分化的细胞，它形成多重指突状的足突。相邻足突之间相互交联形成裂孔，覆盖一层裂孔隔膜，附于肾小球毛细血管基底膜的外侧。足细胞通过抵消肾小球基底膜的向外膨胀作用而稳定肾小球的结构。裂孔隔膜则形成巨大的滤过表面［1］。足细胞的足突具有由肌动蛋白、肌球蛋白、α辅肌动蛋白、黏着蛋白等组成的可收缩结构，这一结构通过其表面的黏附蛋白——α3β1-整合素和肌营养不良蛋白聚糖黏附于基底膜上［2］。血管激素作用于足突这一可收缩结构从而调节肾小球滤过系数。足细胞使肾小球滤过屏障形成特定的分子及电荷特性。足细胞的损伤导致足突回缩及蛋白尿。在许多肾小球疾病中均伴有足细胞的损伤。微小病变肾病、膜性肾病、局灶节段性肾小球肾炎、慢性肾小球肾炎及糖尿病肾病中均发现足细胞形态改变，包括足突回缩，甚至足细胞脱落。目前对于足细胞生物特性的认识有助于进一步了解肾小球功能和疾病。

1 研究足细胞功能的新方法

1.1 通过Patch-clamp法对肾小球原位足细胞的研究 肾小球上有3种类型的细胞，包括足细胞、肾小球内皮细胞及系膜细胞，它们形成一种复杂的结构。由于这种特殊的解剖学位置，很难发现某一类型的肾小球细胞对激素的反应情况。对肾小球细胞生理功能的认识多是通过培养的细胞所获得的。由于在细胞培养过程中常常使细胞丧失其形态学及功能上的特性，故很难将细胞培养获得的结果用于活体环境。此外，不同的肾小球细胞类型也可能相互影响。近年来发展了一种新的技术——Patch-clamp法，能用于观察肾血管球上足细胞的电生理特性［3］。通过这种技术可以研究足细胞在肾小球原位的功能特性。然而，这种操作过程十分困难，能成功获得稳定完整细胞结构的概率不到3%。此外，可出现肾小球结构崩解，从Bowman囊剥落到分离肾小球和实验成功需要相当长的时间。这样，虽然能通过电镜证明足细胞形态完整，但是，足细胞的功能可能已经发生改变［3］。这一技术中的一些难题可以通过新的技术方法来解决。

1.2 对单个足细胞特征性基因表达的研究 为了研究单个足细胞内的基因表达，近来发展一种新的技术能够从单个足细胞中提取出特殊的足细胞mRNA。用神经氨酸酶短时间处理肾小球后，单个足细胞被吸入微量移液器而采集。经过一个冻融循环，足细胞的细胞膜断裂，RNA被提取出来。此后，用特殊序列的寡核苷酸引物扩增cDNA。并进行一系列的对照实验来排除非足细胞的cDNA扩增。通过这一方法，特殊的足细胞标记肾小球上皮细胞蛋白1(glomerular epithelial protein 1，GLEPP-1)、WT-1、血管内皮细胞生长因子的mRNA能扩增28%～67%［4］。单个足细胞的反转录-聚合酶链反应能使人们进一步认识到基因在足细胞中发挥的作用，且能通过半定量分析和了解获得的cDNA量以及能从特殊肾小球疾病患者的肾小球中分离出足细胞。

1.3 通过细胞培养技术对足细胞的研究 过去，人们认为培养增殖出呈鹅卵石样的肾小球上皮细胞为足细胞［4］。与培养的细胞相反，活体内的足细胞增生能力有限，呈章鱼形状外观。此外，培养的肾小球上皮细胞上的许多抗原类型与体内足细胞表面的抗原类型不同。故认为培养的肾小球上皮细胞不是足细胞，而是肾小球壁层上皮细胞。近来，已成功对分化的足细胞进行培养及鉴定。分化的足细胞有足突，且是从未分化足细胞呈鹅卵石样外观的胞体中分化而来。WT-1是一种足细胞特异的核内蛋白，可在分化的及未分化的足细胞核上表达。而突触孔蛋白是一种在活体内定位于足细胞足突的蛋白，仅在分化的足细胞中表达。因此，能够通过足细胞特异抗体来辨认足细胞，并区分分化及未分化的足细胞。分化的足细胞在原代培养中增殖能力有限，故对于需要大量细胞的实验则难以进行。因此，条件性永生足细胞株从一种由转基因小鼠表达的、温度敏感的SV40大T抗原中获得［5］。这种细胞若在37℃条件下培养则会停止生长，而表现出分化足细胞的许多形态学和免疫学特性［5］。毫无疑问，足细胞能通过细胞培养技术生长增殖，相对于原位研究足细胞，体外研究足细胞的生理及分子特性更加容易。虽然通过培养获得的分化足细胞具有体内足细胞的许多特性，但是在细胞培养过程中，该细胞的生物学功能可能发生改变，因此通过细胞培养获得的研究结果需谨慎对待。

2 血管激素对足细胞功能的调节

血管激素激活足细胞上钙离子依赖的氯离子通道。血管激素，如血管紧张素Ⅱ (angiotensin，ANGⅡ)，可调节肾小球滤过率，并可降低肾小球超滤系数Kf。ANGⅡ能增加尿蛋白排泄率，导致肾小球分子选择功能的破坏。作为一种生长激素ANGⅡ能刺激肾小球内皮细胞及系膜细胞的增殖，和细胞外基质蛋白如Ⅳ型胶原的合成。ANGⅡ对于发展为肾小球硬化起重要作用。研究表明，在实验的和临床的肾小球疾病中血管紧张素转换酶抑制剂降低ANGⅡ的水平能减缓肾小球硬化的进展［6］。在肾小球内，ANGⅡ被认为是优先作用于系膜细胞［4］。然而，对比其他抗高血压治疗，对于肾脏次全切除的大鼠肾脏，血管紧张素转换酶抑制剂能改善肾小球功能，减轻足细胞肥大。这提示ANGⅡ可能直接影响足细胞的形态［7］。

氯沙坦能完全地、可逆地抑制ANGⅡ介导的除极反应，这一现象表明足细胞上具有ANGⅡ1型(AT1)受体［3］。ANGⅡ对足细胞功能的影响可以通过内皮细胞或系膜细胞释放的细胞因子和激素发挥间接作用。许多类型的细胞中，激活的AT1受体能使钙离子浓度提高。AT1受体介导的由ANGⅡ诱导的钙离子浓度增高是由细胞内钙池释放钙离子以及从细胞外间隙流入钙离子增多所致［8］。L型的钙离子通道拮抗剂不能抑制ANGⅡ诱导的钙离子流入，这表明钙离子的流入不通过L型钙离子通道。此外，当出现细胞外钾离子浓度增高时，就不会出现钙离子内流增多，这说明足细胞上没有L型钙离子通道。由于非选择性离子通道的拮抗剂能抑制ANGⅡ对钙离子的作用，故钙离子的流入可能是通过开放的非选择性离子通道［8］。

同时，长时间的细胞培养发现未分化的大鼠足细胞表现出 AT1和 AT2受体［9］。令人惊奇的是ANGⅡ能使这些足细胞内cAMP增多，无论ANGⅡ浓度高低引起cAMP增多的程度相当［9］。ANGⅡ介导的cAMP增多仅能被高浓度的氯沙坦或AT2受体拮抗剂部分抑制。当同时存在两种受体拮抗剂时才能完全抑制足细胞内ANGⅡ介导的cAMP增多，表明这一作用是同时通过ANGⅡ两种受体产生的［9］。其他，如地诺前列酮、内皮素、多巴胺等均能调节足细胞上的钙离子浓度。此外，有报道发现，补体C5b-9复合物介导的足细胞损伤与钙离子浓度增高及磷脂酶C的活化有关［10］。

地诺前列酮、多巴胺及异丙肾上腺素均能提高培养的小鼠足细胞内cAMP的浓度，导致一种cAMP依赖的氯离子通道开放［11］。活体内，小鼠的足细胞具有心钠素的受体［12］，而心钠素能诱导人足细胞内cGMP浓度增加［13］。成年或刚出生的大鼠注射心钠素使足细胞内cGMP增多，这表明cGMP的调节在足细胞的发育中有作用［14］。

从生物学角度看，血管激素诱导的足细胞功能改变的重要性表现在以下几个方面。

①激素诱导的细胞信号转导可能改变足细胞足突的收缩性结构，导致肾小球滤系数的改变。对于这一假说缺乏直接的证据，但实验发现钙离子及cAMP浓度增加可使肾小球滤过膜变窄，导致超滤系数下降，而cGMP浓度增加可能对超滤系数起相反的作用［15］。②血管激素也可能改变足细胞表面的电荷特性，而增加尿蛋白的排泄［16］。③去甲肾上腺素及ANGⅡ被认为与急性肾衰竭有关［17］。去甲肾上腺素诱导的急性肾衰竭可能至少部分是由去甲肾上腺素介导的足细胞直接损伤所致。④许多实验性慢性肾衰竭模型中，足细胞损伤出现在进展性肾小球硬化早期并持续出现在疾病过程中。肾小球硬化发病的分子机制尚不完全明了，ANGⅡ及其他血管激素诱导的足细胞信号系统的激活可能是造成慢性肾衰竭足细胞损伤的原因［7］。在足细胞内，三磷酸腺苷(adenosine triphosphoric acid，ATP)能刺激烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶的活化。Heyman肾炎是一种以上皮下免疫复合物沉积及蛋白尿为特征的人类膜性肾病模型，活性氧簇是引起Heyman肾炎的重要介质。细胞色素-b558是NADPH氧化还原酶复合物的重要组成部分，能形成超氧化物。Heyman肾炎的足细胞中发现补体介导的细胞色素-b558的表达。活性氧簇在肾小球基底膜基质局部聚集，这种氧化修饰导致肾小球基底膜上的Ⅳ型胶原分子二聚体形成，引起蛋白尿。近来研究发现培养的人足细胞能产生超氧化物，细胞外ATP作用时间及浓度增加共同引起足细胞产生的超氧化物增加［1］。ATP可活化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸及NADPH氧化酶，而黄嘌呤氧化酶的活性没有改变，这表明NADPH相关的氧化酶是足细胞产生超氧化物的主要来源。通过反转录-聚合酶链反应检测出足细胞内存在NADPH氧化酶亚基 p22phox、gp91phox、p47phox及 p67phoxmRNA 的表达［1］。其中，当ATP增多时p67phox的表达瞬间增加。放线菌素D是一种转录的拮抗剂，放线菌酮是RNA翻译的拮抗剂，均能抑制ATP诱导的NADPH氧化酶的活化，这表明ATP能调节转录及翻译水平的酶的活性［1］。ATP引起的超氧化物产物的活化以及其他血管激素引起的类似作用被认为在激素诱导的足细胞损伤方面起重要作用。进一步研究明确足细胞内NAD(P)H氧化酶系统的其他不同作用，以及运用单个NADPH氧化酶复合物亚基的拮抗剂能否减轻足细胞损伤。

3 对足细胞特异性标记蛋白的认识

近来，研究发现足细胞许多新的特征性标记蛋白，如 Megalin、Nephrin、Podoplanin、GLEPP-1 及 Synaptopodin等。

3.1 Megalin Megalin是一种相对分子质量为600×103的跨膜蛋白，属于低密度脂蛋白受体基因家族。Heyman肾病的大鼠足细胞内，Megalin与相应抗体形成免疫复合物沉淀［18］。Megalin是一种细胞内受体，与大鼠足细胞摄取脂蛋白有关［19］。此外，在肾脏，它作为一种受体用于在肾小球近曲小管重吸收多种不同的分子［20］。

3.2 Nephrin 芬兰型先天性肾病综合征是一种常染色体隐性遗传病，是以胎儿时期出现蛋白尿以及出生即出现肾病变为特征。近来，通过定位克隆技术发现NPHS1是芬兰型先天性肾病综合征累及的主要基因［21］。Nephrin是一种相对分子质量为135×103的跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员，特异表达在足细胞上［21］。Nephrin的生理作用尚不清楚，但认为它是一种黏附受体，以及一种信号蛋白，在维持足细胞足突完整性方面发挥极其重要的作用［21］。

3.3 Podoplanin Podoplanin是一种相对分子质量为43×103糖蛋白，定位于足细胞表面［22］。在其他细胞中，如肺上皮细胞及成骨细胞，存在与Podoplanin有类似序列的糖蛋白［22］。嘌呤霉素肾病及微小病变肾病中Podoplanin转录下调［22］。对大鼠注射多克隆的兔抗鼠Podoplanin抗体IgG后，IgG选择性地连接在足细胞上。一些IgG可诱导足细胞足突回缩，出现瞬时蛋白尿。Podoplanin在维持足突结构及肾小球通透性的方面发挥重要的作用。

3.4 GLEPP-1 GLEPP-1是一种相对分子质量为132×103的膜蛋白-酪蛋白磷酸酶，它由一个巨大的细胞外结构域，一个跨膜区域及一个蛋白-酪蛋白磷酸酶结构域组成［23］。GLEPP-1表达在足突上及脑组织内。人们认为GLEPP-1通过调节足细胞内蛋白的酪氨酸磷酸化，从而维持足突结构［23］。在造成肾小球损伤的一种兔抗肾小球基底膜模型中发现GLEPP-1蛋白表达减少，而在新月体肾病的肾活检组织中发现局灶或弥漫的GLEPP-1蛋白表达减少［24］。

3.5 Synaptopodin Synaptopodin是一种肌动蛋白相关蛋白，表达在足突及端脑上［25］。Synaptopodin仅表达在成熟的足细胞上，因此可作为足细胞成熟度的标志。它的作用尚不清楚，但认为它影响足突的活力［25］。在人肾小球病中仍有 Synaptopodin的表达，这与出现可逆的足突融合有关。另一方面，在毛细血管壁坏死的部位、细胞新月体形成的部位，或局灶节段性肾小球硬化的早期及进展阶段，Synaptopodin的表达消失［21］。

特发性肾小球硬化症，是局灶阶段性肾小球硬化的一种严重类型，预后不良。人们发现该病出现足细胞形态的改变，伴随 Synaptopodin、WT-1、GLEPP-1、Podocalyxin的表达减少以及增殖标记Ki-67的表达增加［26］。在HIV相关肾病，足细胞标记蛋白的表达有类似的改变，而在微小病变肾病及膜性肾病中，上述标记蛋白的表达不受影响［26］。因此认为，Synaptopodin及其他足细胞特异的标记蛋白表达减少与足细胞形态改变有关。

总之，生理学、分子生物学及细胞培养技术的进步使人们更清楚地认识到血管激素对足细胞的作用，以及足细胞上新发现基因的功能。对引起足细胞形态改变以及足突回缩的信号传导途径的认识能有助于更好地了解蛋白尿的病理机制，从而可能从中找到治疗肾小球疾病的新策略。

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