重组人干扰素α2b喷雾剂的抗病毒药效评价及临床观察

曹琳，张磊，田莉，邓杰

重组人干扰素 α2b是一种广谱的抗病毒药物，对乙型肝炎、单纯疱疹、带状疱疹、尖锐湿疣、疱疹性口炎、流感病毒等均有抑制作用，但是临床上常规使用的干扰素剂型多为肌肉或静脉注射给药，对病毒造成的局部皮肤或黏膜感染体内半衰期短，难以在病变部位达到有效剂量，而加大给药剂量又会增大干扰素对机体的毒副作用，限制了其临床广泛应用。因此，将干扰素开发成外用经皮给药剂型对皮肤病毒性感染疾病治疗具有现实意义[1-2]。本文针对拟定适应证利用细胞病变抑制法（CPE）设计了体外抗单纯疱疹病毒 I 型及II 型、流感病毒甲型及乙型以及SARS 冠状病毒药物有效性试验模型，研究重组人干扰素 α2b 喷雾剂（rIFN α2b）对相关病毒的体外抗病毒作用，为进一步开展临床研究提供依据，并开展了临床治疗单纯疱疹和尖锐湿疣验证。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 受试药物 重组人干扰素 α2b 喷雾剂，20ml/支，rIFN α2b 含量为10万 IU/ml；对照品为空白基质，包装与受试药物相同，均由天津华立达生物工程有限公司提供，2～10 ℃ 保存。阳性对照药物酞丁安搽剂（喷雾型）0.5%（W/V）×10ml，生产厂家为北京四环制药厂，分装于外形与受试药物相同的瓶内，遮光、密闭在阴凉处保存。人标准干扰素 α 2.4万 IU/ml，购自中国药品生物制品检定所。

1.1.2 病毒株 单纯疱疹病毒 I 型 Sm44 株（HSV-1）购自中国药品生物制品检定所；单纯疱疹病毒 II 型 333 株（HSV-2）、流感甲型病毒90-15、流感乙型病毒 95-184 均由中国预防医学科学院病毒所惠赠；SARS 冠状病毒北京一号（BJ-01）由北京华大基因研究中心试验室保存。

1.1.3 细胞株 非洲绿猴肾传代细胞（Vero）来源于美国模式菌种保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），中国医学科学院医学生物学研究所保存；人胚肾原代细胞（HEK）按常规制备，细胞长成单层后用于实验。

1.1.4 培养基 Eagle’s MEM 为美国 Gibco公司产品；DMEM 为美国 Invitrogen公司产品；胎牛血清为美国 Gibco公司产品。

1.1.5 试剂 青霉素、链霉素和卡那霉素为华北制药厂产品；4-羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）、非放射性细胞增殖检测试剂盒（MTS）、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）为美国 Promega公司产品；四甲基偶氮唑盐（MTT）为美国 Sigma公司产品；L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、十二烷基磺酸钠（SDS）为北京化学试剂公司进口分装。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养液及试剂配制 DMEM 培养液含 10% 新生胎牛血清、3% L-谷氨酰胺、青霉素、链霉素各 100μg/ml、7.5% 碳酸氢钠、10 mmol/L Hepes；MTS/PMS 染色液按 Promega公司的操作指南配制。

1.2.2 受试药物对细胞毒性试验 受试药物以细胞培养液稀释或溶解到特定浓度，倍比稀释药物，共 8个稀释度。将药物加到含目标细胞并已培养24 h的96 孔板，每孔培养液 100 μl，空白基质同样处理，另设正常细胞对照。37 ℃ 下 5% CO2培养细胞 48 h，显微镜下观察细胞形态。加 MTS/PMS，每孔 20 μl，37 ℃ 下 5% CO2培养 3 h，加50 μl 10% SDS 检测 490 nm 下的OD 值作为细胞健康状况指标，以样品读数不小于正常细胞对照的90% 作为无毒性指标，计算引起 50% 细胞形态的药物毒性浓度（TD50）或致半数细胞毒性所需浓度(CC50)。

1.2.3 受试药物对病毒细胞病变（CPE）的抑制试验 将（2～3）×105个细胞/ml 接种96 孔细胞培养板，每孔 100 μl，37 ℃ 下 5% CO2培养 24 h，细胞长成单层，弃培养液，加入一系列无细胞毒性的2 倍稀释的受试药物，每孔 100 μl，37 ℃ 下5% CO2培养 24～96 h，弃培养液，用培养液洗一次，再用一定稀释度病毒感染已预先用受试药物处理 24 h的细胞，37 ℃ 吸附 1 h，弃病毒液，加维持液继续培养。期间，显微镜下观察细胞病变，待病毒对照出现 4个加号病变时（约感染后30 h 左右），以 MTS 法检测细胞健康状况。试验时设药物毒性对照、空白基质对照、正常细胞对照、病毒对照、人标准 IFNα 阳性对照及病毒毒力滴定。CPE 分级标准：无细胞病变为0，25% 以内病变为1，25%～50% 为2，50%～75% 为3，＞75%为4。空白基质对照同样处理，设病毒感染对照及正常细胞对照。计算抑制 50% 病毒细胞病变的最小有效浓度（IC50），治疗指数（TI=TD50/IC50）。

1.2.4 临床试验 采用多中心、随机、双盲对照临床试验，患者按照随机号进入试验。

1.2.4.1 I 型和II 型单纯疱疹治疗 治疗前记录水疱发生的部位、皮损面积、数目。患者自行将受试药物或空白基质对照药物外用喷于患处，每天3 次，疗程 7 d。疗效评价标准：痂全部脱落，且无炎症反应，主观症状消失为治愈；全部结痂，主观症状消失为显效；部分结痂，主观症状有好转为进步；皮损改变不明显，或有新发皮疹为无效。

1.2.4.2 尖锐湿疣治疗 治疗前记录疣体发生的部位、数目、疣体的外形（包括乳头状、鸡冠、菜花、扁平疣状、小丘疹）和靶疣体大小等。患者每2周复诊1 次。患者自行将受试药物或空白基质对照药物外用喷于患处，每天 4 次，疗程 6周。疗效评价标准：疣体完全消退为痊愈；疣体数目或面积减少 60% 以上为显效；疣体数目或面积减少20%～60% 为进步；疣体数目或面积减少＜20%或继续加重为无效；4周无效者，若患者要求退出则按无效处理。

1.3 统计学处理

临床试验全部结束后，汇总病例记录表，分试验组及对照组分别统计比较，所有数据经 SAS 统计软件包处理。资料采用卡方检验、秩和检验和t检验。总有效率=[（显效例数 + 治愈例数）/全部病例数]×100%。

2 结果

2.1 重组人干扰素 α2b 喷雾剂抑制单纯疱疹病毒 I 型及II 型对 Vero 细胞的CPE 作用

在所使用的药品浓度范围，rIFN α2b和空白基质对 Vero 细胞无毒性。显微镜下观察未见 rIFN α2b和空白基质对 Vero 细胞形态有可辨别的影响。rIFN α2b 喷雾剂的半数有毒浓度 TD50(CC50) ＞10000 IU/ml。

表1 重组人干扰素 α2b 喷雾剂抑制 HSV-1及HSV-2 CPE 试验结果Table1 The CPE assays of rIFN α2b spray on HSV-1 and HSV-1 attacking Vero cells

表2 重组人干扰素 α2b 喷雾剂抑制流感病毒 CPE 试验结果Table2 The CPE assays of rIFN α2b spray on influenza virus type I and type II attacking HEK cells

CPE 试验表明 rIFN α2b 抑制 HSV-1 感染Vero 细胞的IC50为81.2 IU/ml，TI ＞1231；抑制HSV-2的IC50为390.0 IU/ml，TI ＞256（表1）。空白基质对 HSV-2 CPE无抑制作用。

2.2 重组人干扰素 α2b 喷雾剂抑制流感病毒甲型及乙型对 HEK 细胞的CPE 作用

rIFN α2b组三批实验的TD50均为29.1万IU/ml，空白基质对照对细胞的毒性稀释度与喷雾剂相同。

CPE 试验表明 rIFN α2b 抑制流感病毒甲型感染 HEK 细胞病变的平均 IC50为534.1 IU/ml，治疗指数 TI ≥ 544.8；抑制流感病毒乙型感染HEK 细胞病变的平均 IC50为3645.5 IU/ml，治疗指数 TI ≥ 79.8（表 2）。空白基质各稀释度均无抑制流感病毒甲型及乙型 CPE的作用。

2.3 重组人干扰素 α2b 喷雾剂抑制 SARS 冠状病毒对 Vero 细胞的CPE 作用

在所使用的药品浓度范围，rIFN α2b和空白基质对 Vero 细胞无毒性。显微镜下观察未见 rIFN α2b和空白基质对 Vero 细胞形态有可辨别的影响。rIFN α2b 喷雾剂的半数有毒浓度 TD50(CC50) ＞10000 IU/ml。

CPE 试验表明 rIFN α2b 抑制 SARS 冠状病毒感染 Vero 细胞病变的平均 IC50为11.77 IU/ml，其治疗指数 TI ＞849.6。形态观察显示，rIFN α2b喷雾剂对 SARS 病毒对 Vero 细胞的攻击有显著的抑制作用。空白基质对 SARS 冠状病毒 CPE 无抑制作用。

rIFN α2b 喷雾剂对 SARS 病毒感染的Vero细胞抑制作用依赖于rIFN α2b的浓度。根据浓度曲线（图 1），用 Prizm 软件分析得 IC50值为11.77 IU/ml。

图1 重组人干扰素 α2b 喷雾剂抑制 SARS 冠状病毒CPE 试验结果Figure1 The CPE assay of rIFN α2b spray on SARS coronary virus attacking Vero cells

2.4 重组人干扰素 α2b 喷雾剂治疗 I 型和II型单纯疱疹临床实验

单纯疱疹临床试验共计入选 221 例，完成的合格病例217 例（试验药物组110 例，空白基质对照组107 例），因各种原因退出4 例（试验药物组失访 2 例，对照组失访 2 例），入选时两组患者的年龄、性别及皮损严重程度均无统计学差异（P ＞0.05）。

试验组与对照组相比较，两组间的开始结痂时间、全部结痂时间、开始脱痂时间及全部脱痂时间，在治疗第 2、3、5、7、10 天的治愈率、显效率、有效率试验组均高于对照组；两组间总体疗效试验组均高于对照组，有显著性差异，P＜0.05（表 3）。治疗结束后，医生对疗效的主观评价为“好”和“良好”的比例：试验组89.09%（98/110），空白基质对照组59.81%（64/107），经卡方检验 χ2=24.57，P＜0.001，两组有显著性差异。

试验组出现局部皮肤干燥 2 例；对照组出现轻度瘙痒 1 例，轻度刺痛 1 例，不良反应发生率为试验组1.81%（2/110），对照组1.87%（2/107）。

表3 重组人干扰素 α2b 喷雾剂和空白基质治疗单纯疱疹疗效对比Table3 The treatment effect of rIFN α2b spray on herpes simplex

表4 重组干扰素 α2b 喷雾剂与酞丁安搽剂治疗尖锐湿疣对比Table4 The treatment effect of rIFN α2b spray on condyloma acuminatum

2.5 重组人干扰素 α2b 喷雾剂治疗尖锐湿疣临床实验

受试药物实验组和酞丁安搽剂对照组治疗尖锐湿疣共入选病例125 例。干扰素喷雾剂治疗组61 例，其中中途退出2 例（失访），可评价疗效与安全性 59 例。酞丁安搽剂组64 例，其中中途退出3 例（失访），可评价疗效与安全性 61 例。两组间年龄、性别、病程及治疗前两组间平均疣体数目、平均疣体面积、疣体形态等经统计学检验均无显著性差异（P ＞0.05）。

经过两种药物治疗 4～6周后，均有患者的疣体消退。试验第 6周时，通过计算对比每一患者治疗前后疣体数目和面积的改变，分别统计出两组的治愈率及总有效率。干扰素喷雾剂组治愈率为17.0%（10/59）、总有效率为22.0%（13/59）；酞丁安搽剂组治愈率为14.8%（9/61）、总有效率为22.9%（14/61），经卡方检验分别为χ2=10和χ2=0.014，P ＞0.5，两组无显著性差异（表 4）。

6周的疗程中，两组患者均未发现系统不良反应。两组共有 10 例患者在治疗过程中出现局部不良反应，不良反应发生率为试验组6.8%（4/59），对照组9.8%（6/61），主要表现为局部刺激反应如轻度红肿、灼痛和瘙痒等，表现轻微可自行缓解。

3 讨论

体外实验表明重组人干扰素 α2b 喷雾剂对 I型和II 型单纯疱疹病毒、甲型和乙型流感病毒、SARS 冠状病毒有显著抑制作用。临床研究表明重组人干扰素 α2b 喷雾剂对 I型和II 型单纯疱疹病毒感染具有很好的治疗效果，推荐使用方法3 次/天，外用于皮损局部。重组人干扰素 α2b 喷雾剂对尖锐湿疣有一定的疗效，可用于辅助治疗。

重组人干扰素 α2b 喷雾剂是蛋白质经皮给药技术的创新性尝试，解决了干扰素液体稳定性的技术瓶颈，采用非接触，定量经皮给药方式，使用安全、卫生、方便，无明显不良反应，相对于常规的注射给药方式有其独特的优越性。本研究也为干扰素经皮给药治疗带状疱疹、口腔溃疡、疱疹性口炎以及流行性感冒等多种疾病的研究奠定了基础。

[1]Zhang L, Liu R.Research progress in drug delivery for interferon.China Prescription Drug, 2003, 15(6):50-51.(in Chinese)张磊, 刘睿.干扰素给药研究.中国处方药, 2003, 15(6):50-51.

[2]Zhang L, Deng J, Tian L, et al.Study on stable interferon liquid formulation.Pharm Biotechnology, 2005, 12(5):383-388.(in Chinese)张磊, 邓杰, 田莉,等.液体稳定干扰素及其相关研究.药物生物技术, 2005, 12(5):383-388.