大孔树脂纯化黑粒小麦麸皮色素及其初步鉴定*

李伟，姜媛，唐晓珍，董玉秀，张宪省

1(山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安，271018)

2(山东省科学技术情报所，山东济南，250101)

大孔树脂纯化黑粒小麦麸皮色素及其初步鉴定*

李伟1，姜媛2，唐晓珍1，董玉秀1，张宪省1

1(山东农业大学食品科学与工程学院，山东泰安，271018)

2(山东省科学技术情报所，山东济南，250101)

研究了AB-8型大孔树脂对黑粒小麦麸皮色素的吸附与解吸条件，并利用高效液相色谱法对纯化后的色素成分进行了初步的分析。结果表明:黑粒小麦麸皮色素在AB-8型大孔树脂上的吸附平衡时间为26 h，解吸平衡时间为7h，pH对大孔树脂的吸附率影响不大，pH值为1.0的70%的乙醇溶液可以很好的洗脱色素。在该条件下，测得AB-8型大孔树脂最大吸附率为83.00%，最大解吸率为85.53%。纯化后的色素有4个主要成分，为花色苷类化合物。

黑粒小麦麸皮，花色苷，大孔树脂

彩粒小麦是指籽粒果种皮或糊粉层颜色与生产上常用小麦不同的小麦，现已经报道的有紫粒、黒粒、蓝粒、蓝紫粒、绿粒小麦等，含有丰富的花色苷［1－2］，花色苷是花青素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，具有有促进视红素再合成、抗炎症、提高免疫力、抗心血管疾病、抗衰老、抗癌等多种生理功能，在食品、药品、化妆品等领域有着广阔的应用前景［3］。

国内外对彩粒小麦色素的研究主要集中在提取、生理功能及成分分析等方面［1－4］，关于纯化的研究较少。目前对于花色苷类化合物纯化的方法主要有大孔树脂精制法、超滤法及高速逆流色谱法，其中大孔树脂法以其吸附容量大、选择性好、成本低、再生简便且成本低等特点被广泛用于天然产物的分离纯化［5－6］。为了对黑粒小麦中的花色苷资源进行全面的开发利用和深加工，本实验以黑粒小麦麸皮为原料，AB-8型大孔树脂的对其吸附和解吸性能进行了研究，并利用高效液相色谱对纯化后的组分进行了初步的分析鉴定。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黑粒小麦麸皮:黑粒小麦由山东农业大学孙兰珍老师培育、提供。将籽粒洗净晾干，磨粉得黑粒小麦麸皮。

1.2 试验仪器

UV-2501PC型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司;BS-150A电子天平，上海友声衡器有限公司;HH-6数显恒温水浴锅，江苏常州国华电器有限公司;酸度计，美国Thermo公司;TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂;RE52CS旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂;SHZ-ⅢD型循环水真空泵，上海亚荣生化仪器厂;超高效液相色谱仪-质谱仪，美国沃特世(Waters公司);Sun FireTMC18(4.6 mm ×150 mm，5 μm)色谱柱，美国Waters公司。

1.3 试验试剂

无水乙醇、HCl、NaOH，天津市凯通化学试剂有限公司，均为分析纯试剂;乙腈、甲醇、乙醇，均为色谱纯，美国Fisher公司;甲酸，美国Alfa Aesar公司;AB-8型大孔吸附树脂，天津伟强锅炉净化材料有限公司。

1.4 实验方法

1.4.1 黒粒小麦麸皮色素提取物的制备

准确称量黒粒小麦麸皮1.00 g，用pH值1.0的体积分数为40%的乙醇溶液按料液比1∶20(g∶mL)比例加入提取剂，于70℃下浸提80 min，倒出上层液冷却至室温，离心10 min(转速4 800 r/min)，除去沉淀得色素提取液。

1.4.2 黒粒小麦麸皮色素吸收光谱图及测定方法

用UV-2550型紫外-可见分光光度计在200～600 nm波长内扫描，以提取剂为参比，测色素提取液的吸收光谱，以最大吸收波长(λmax)处的吸光度值表示色素的浓度［6］。

1.4.3 AB-8型大孔树脂纯化黑粒小麦麸皮色素

1.4.3.1 树脂的活化

取新买来的AB-8型大孔树脂用去离子水洗净，在烧杯内加入高于树脂层10 cm的体积分数95%乙醇在室温下密封浸泡8 h，用去离子水洗至中性后用5%的HCl浸泡8 h，去离子水洗至中性后再用5%NaOH浸泡8 h，用蒸馏水洗至中性后装柱，用95%乙醇洗至流出液用水稀释不浑浊为止，再用去离子水洗至无醇气味，备用。

1.4.3.2 树脂吸附率和解吸率的测定

准确称取预处理的大孔树脂若干份，每份各2.0 g置于100 mL锥形瓶中，再加入50 mL pH值为1.0的色素提取液，最大吸收波长(λmax)处测其吸光值。充分吸附24 h后，测定其在最大吸收波长处的吸光度A1，向滤出的树脂中加入50 mL pH值1.0的体积分数60%乙醇溶液，振荡24 h，充分解吸后过滤测滤液的吸光度值A2，计算其吸附率α和解吸率β［7］。

式中:A0，色素溶液纯化前的吸光度值;A1，大孔树脂吸附色素后溶液的吸光度值，A2，大孔树脂解吸后色素溶液吸光度值。

1.4.3.3 吸附平衡时间和解吸平衡时间的测定

取已预处理的树脂2 g加入pH值为1.0的色素提取液20 mL在水浴振荡器内以150 r/min，每隔0.5 h进行测定吸光值，直到数值稳定为止，测定吸附平衡时间;取已吸附好的树脂2 g若干份，每份加20 mL洗脱剂在水浴振荡器内以150 r/min，每隔0.5 h进行测定吸光值，直到数值稳定为止，测定解吸平衡时间。

1.4.3.4 pH值对AB-8型大孔树脂吸附的影响

称取经预处理的AB-8型大孔树脂5份，每份2 g色素提取液分别调 pH 值至 1.0、2.0、3.0、4.0、，分别加入25 mL至锥形瓶中，于摇床150 r/min吸附24 h，测定色素溶液在可见光最大吸收波长处的吸光度，计算吸附率。

1.4.3.5 乙醇体积分数对AB-8型大孔树脂解吸率的影响

取吸附花色苷饱和的大孔树脂2 g若干份，加入体积分数为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的pH值1.0的乙醇溶液25 mL，30℃150 r/min吸震荡2 h，取洗脱的花色苷溶液1 mL，λmax处测定吸光度值，计算解吸率。

1.4.3.6 大孔树脂动态吸附试验

通过查阅资料文献确定吸附流速和洗脱流速，对大孔树脂装层析柱后对色素提取液进行纯化:采用pH值为1.0，吸光度值为0.6的色素溶液进行上样，流速为3 BV/h上柱，选择pH=1的70%的乙醇水溶液解吸溶剂，洗脱流速1BV/h。

1.4.3.7 色价的测定

精确称取自制的花色苷0.05 g，用pH值3.0的柠檬酸缓冲液定容至100 mL容量瓶中，稀释至一定倍数，在520 nm处测定其吸光度值，用公式:色价=A×r/m计算色价，式中A为吸光度值，r为测定时所吸取的样品的稀释倍数，m为样品的质量(g)［8］。

1.4.4 高效液相色谱法对纯化后黑粒小麦麸皮色素的初步分离鉴定

应用超高效液相色谱系统配以光电二极管阵列检测器［9］。样品分离采用Sun FireTMC18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色谱柱，柱温 40℃。运行时间:20.00 min，梯度洗脱，流动相A为甲醇，B为0.1%甲酸水，0～13 min:A由10%的变为52%，B由90%的变为48%;13～15 min:A由52%变为90%，B由48%变为10%;15～17.5 min:A由90%变为10%，B由10%变为90%，流速为0.800 mL/min，进样体积:10ul。光电二极管阵列检测器扫描范围200～800 nm。

2 结果与分析

2.1 光谱特征

图1 黑粒小麦麸皮色素紫外全扫描图(200～800 nm)

由图1可见，以pH值=1.0的乙醇浸提，所得色素提取液在紫外光区280～285 nm有较强的吸收峰，为花色苷化合物特征峰;在可见光范围内的最大吸收在525 nm处，为典型的花青素光谱特性［10］。自然界花青素多以与糖苷键结合的形式存在，所以推断黑粒麸皮色素为花色苷类，这与前人研究结果相符［1－2］，确定最大吸收波长(λmax)为525 nm。

2.2 AB-8型大孔树脂对黑粒小麦麸皮色素的纯化

2.2.1 吸附率、静态吸附时间的测定

图2 AB-8型大孔树脂对黒粒小麦麸皮色素的吸附率随时间的变化

由图2可以看出，AB-8型大孔树脂对黑粒小麦麸皮色素静态吸附率随时间的延长而逐渐增大，26 h时树脂的吸附率达到最大为51.51%，到28h时吸附率略有降低为51.44%，说明在26 h时大孔树脂对色素的吸附已经达到吸附平衡。因此，在以后的大孔树脂树脂静态吸附试验时均固定吸附时间为26 h。

2.2.2 解吸率、解吸时间的测定

图3 AB-8型大孔树脂对黒粒小麦麸皮色素解吸率随时间的变化

由图3可以看出，AB-8型大孔树脂对黑粒小麦麸皮色素解吸率随时间的延长而增大后趋于平缓，6 h时树脂的解吸率达到最大为65.11%，之后解吸率略有降低，说明在6 h时大孔树脂达到解吸平衡，确定解吸时间为6 h。

2.2.3 色素溶液的pH值对吸附效果的影响

表1 AB-8型大孔树脂对不同pH值的色素溶液的吸附率

由表1可以看出，随着色素溶液pH值的升高，大孔树脂对色素的吸附率整体呈下降趋势，但是总体相差不大，说明吸附效果接近，色素溶液的pH值对树脂的吸附率影响不大。由于色素提取液的最佳提取pH值为1.0，因此选择pH值1.0为大孔树脂的最适吸附pH值。

2.2.4 最佳洗脱剂乙醇浓度的选择

图4 大孔树脂在不同乙醇浓度下对色素溶液的解吸率

由图4可以看出，随着乙醇浓度的增大解吸率先增大后趋于平稳，这是因为不同浓度溶液的极性对色素的溶解不同，对解吸产生影响。乙醇体积分数为70%、80%、90%的显著性差异不明显，所以选择pH值1.0的70%的乙醇水溶液为色素的最佳洗脱剂。

通过AB-8型大孔树脂对黑粒小麦麸皮色素的静态吸附试验确定了大孔树脂的吸附时间为26 h，解吸时间为6 h，采用吸附的色素溶液pH值为1.0，洗脱剂为70%的酸化乙醇溶液。在此条件下测定大孔树脂对色素溶液的最大吸附率为83.00%，最大解吸率为85.53%，这说明AB-8型大孔树脂可以很好对黑粒小麦麸皮色素进行吸附与解吸，达到纯化色素的目的。

2.2.5 大孔树脂动态吸附试验

黑粒小麦麸皮色素通过AB-8型大孔树脂柱层析柱动态吸附，纯化出来的色素的色价E1%1cm=40.89，色价比粗提物提高了9.13倍。通过大孔树脂纯化的色素提取液透明澄清，放置多天不会出现多糖、酸等的沉淀物，但是大孔树脂只能对麸皮色素提取液进行纯化，并不能将其中的化合物分离开，对其中的组成成分的分析需要进一步研究。

2.3 高效液相色谱法对大孔树脂纯化后麸皮色素的初步分离鉴定

本实验利用HPLC-DAD对大孔树脂纯化后的黑粒小麦麸皮色素进行了检测分析，光电二极管阵列检测器200～800 nm波长范围扫描分析。由图5的HPLC色谱图中可以看出分离出4个主要的色谱峰，按照出峰时间检测的4个色谱峰的吸收峰分别为:7.241 min(276 nm/347 nm/526 nm)、7.652 min(277 nm/347 nm/527 nm)、8.142min(282 nm/327 nm/518 nm)、8.594min(282 nm/523 nm)。由图6分析分离出的4个色谱峰的紫外吸收光谱显示出这些化合物均在275 nm和520 nm左右的2个波长处有吸收峰，这是花色苷类化合物的特征吸收峰，因此确定为花色苷类物质。根据花色苷在330 nm左右有无吸收峰可以判断该色素分子是否有酰基，由图6可知前3个色谱峰的化合物在330 nm左右都有吸收峰，因此确定这些化合物为花色苷类物质且有酰基化结构，第4个为无酰基化结构的花色苷类化合物［11－12］。

图5 黒粒小麦麸皮色素提取物的HPLC色谱图(525 nm)

图6 时间7.241min(A)、7.652min(B)、8.142min(C)、8.594min(D)色谱峰处(200～800 nm)紫外全扫描图

以上结果表明，黒粒小麦麸皮中的色素提取液中含有的物质为多种花色苷类化合物，利用高效液相色谱可以对花色苷进行很好的分离，并且可以利用二极管阵列检测器检测到的紫外可见吸收光谱加以区分。

3 结论

通过AB-8型大孔树脂对黑粒小麦麸皮色素的静态吸附实验，确定了大孔树脂的吸附平衡时间为26 h，解吸时间为6 h，采用吸附的色素溶液pH值为1.0，洗脱剂为体积分数70%的酸化乙醇溶液，AB-8型大孔树脂对麸皮色素提取液的最大吸附率为83.00%，最大解吸率为85.53%。纯化出的色素的色价E1%

1cm=40.89，色价比粗提物提高了9.13倍。利用高效液相色谱法对纯化后的色素溶液分离，分离出的4个主要组分分析确定为花色苷类化合物，其中有3个组分为花色苷类酰基化的化合物，1个是无酰基化结构的化合物。

采用大孔树脂纯化色素具有安全无毒、处理量大、纯化效果显著等优点，具备极高的工业化价值［13］。更准确的色素中花色苷的结构鉴定有待于进一步分析，并应用HPLC、质谱、核磁共振等手段对色素进行更加深入的研究。

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Identification and Purification of Pigments in Black Wheat Bran by Macroporous Resin

Li Wei1Jiang Yuan2Tang Xiao-zhen1Dong Yu-xiu1Zhang Xian-sheng1
1(College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China)
2(Shandong Science Technique Intelligence Office，Jinan 250101，China)

Studied adsorption and desorption conditions of AB-8 type macroporous resin to black wheat bran pigment，and HPLC were applied to identify the purified pigments．It was found that the absorption and desorption equilibrium time of black wheat bran in AB-8 type macroporous resin was 26 h and 7h．The affect of pH to macroporous resin adsorption rate is not significant．70%ethanol solution(pH=1.0)was used to desorption pigment．In this condition，the AB-8 macroporous resin maximum adsorption rate is 83.00% and the maximum desorption rate is 85.53%．Four main anthocyanins component was found in purified pigments．

black wheat bran，anthocyanins，macroporous resin

硕士研究生(唐晓珍副教授为通讯作者，E-mail:txz@sdau．edu．cn)。

*国家博士后基金(20100481294)，作物学国家重点实验室开放课题(2010KF15)，山东省优秀中青年科学家科研奖励基金(BS2009NY036)，山东省博士后创新项目专项资金(200903028)，山东农业大学青年科技创新基金项目(23693)

2011－03－03，改回日期:2011－06－29