大孔吸附树脂纯化小米酚类化合物的工艺条件研究

王若兰 田志琴 孔祥刚 李东岭

大孔吸附树脂纯化小米酚类化合物的工艺条件研究

王若兰 田志琴 孔祥刚 李东岭

(河南工业大学粮油食品学院，郑州 450052)

为了分离纯化小米多酚粗提物，选取4种大孔吸附树脂，分别采用静态吸附、解吸试验比较其对小米多酚的吸附分离效果，筛选出吸附分离小米多酚粗提物效果较优的大孔树脂，并对其动态吸附性能进行考察，结果表明:AB－8型树脂对小米多酚粗提物具有较好的吸附和解吸效果，其最佳工艺条件为，吸附过程:上柱速率2 mL/min、上样液pH 4左右、上样液质量浓度在0．12～0．14 mg/mL范围内;洗脱过程:采用体积分数为70%的乙醇溶液以1 mL/min洗脱速率进行洗脱。

小米 多酚化合物 大孔树脂 纯化

从小米中提取的多酚类物质包括两类:羟基苯甲酸和羟基肉桂酸。羟基苯甲酸直接来源于苯甲酸(安息香酸)，包括没食子酸、对羟基苯甲酸、香草酸、紫丁香酸和原儿茶酸;羟基肉桂酸含有C6—C3结构，包括香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸［1］。G Sripriy等［2］、Prashant等［3］、Sanaa 等［4］都报道了小米中的多酚提取物对各种自由基具有清除作用。但目前我国对小米多酚的研究也仅限于提取，而天然产物的开发利用很难仅经提取得到的粗品实现，按文献中的方法提取出的小米多酚，实际上是一种多酚含量较低的粗品，单宁、低分子质量多酚、简单酚、黄酮类化合物，甚至糖类和色素等其他物质也包含在内［5－6］，因而以这种粗品的形式，酚类物质的独特作用可能发挥不充分或达不到要求，无法做进一步研究。所以纯化成为小米多酚利用过程中必不可少的一步。

目前，纯化多酚类化合物的方法包括有机溶剂萃取法、沉淀分离法、层析分离法、膜分离技术、HPLC技术等［7］。大孔吸附树脂由于具有选择性好、机械强度高、再生处理方便、吸附速度快等优点，近年被广泛用于天然产物，包括中药的分离和富集及食品活性成分的分离和纯化，如皂苷、黄酮、蛋白质、多肽和酚类等物质［8］。因此，采用大孔树脂层析法来探讨其对小米多酚粗提取纯化的最佳工艺条件。

1 材料与方法

1．1 材料与仪器

小米:产地山西，品种为晋谷9号;小米籽粒经筛选除去杂质后粉碎过80目筛，脱脂后待用。

没食子酸标准品:General Material公司;Foin－Ciocalteu显色剂:自制;其他试剂均为国产分析纯。

树脂:AB －8、DM －130、DM －301、NKA －9，均购自天津市海光化工有限公司，各树脂的物理特性见表1。

表1 大孔吸附树脂的物理特性

JXFM110型锤式旋风磨:上海嘉定粮油仪器有限公司;M700美的微波炉:广东美的微波炉制造有限公司;GL－20GⅡ型高速冷冻离心机:上海安亭科学仪器厂;PE－52型旋转蒸发装置:上海亚荣生化仪器厂;FD－1－50型真空冷冻干燥机:北京博医康实验仪器有限公司;KQ－250B超声波清洗器:昆山市超生仪器有限公司;752N紫外可见分光光度计:上海菁华科技仪器有限公司;THZ－82B气浴恒温振荡器:江苏省金坛市医疗仪器厂;BS－160A自动部分收集器:上海市沪西机电厂;BT－200B数显横流泵:上海沪西分析仪器厂有限公司。

1．2 方法

1．2．1 树脂的预处理

将市售各种树脂先依次用丙酮、100%乙醇在室温下密封浸泡48 h;然后用5%NaOH浸泡8 h，蒸馏水洗至中性;再用5%HCl浸泡8 h，用蒸馏水洗至中性;且洗出液与蒸馏水等量混合不显浑浊为止。处理后的各树脂密封保存，备用。

树脂每次处理完多酚后要再生处理。再生时先用95%乙醇浸泡24 h，洗净乙醇后再按预处理方法用5%NaOH与5%HCl溶液处理即可。

1．2．2 供试液的制备

将脱脂的小米粉采用文献［6］优化的方法提取多酚，于40℃下经旋转蒸发器浓缩、真空冷冻干燥得小米多酚粗提取物，然后在超声波辅助条件下，用水溶解，抽滤得清液待用。

1．2．3 小米中多酚类物质的测定方法

以没食子酸作为标准物，采用Foin－Ciocalteu法［9－10］测定总酚含量，以没食子酸作为标准物。

1．2．3．1 Foin －Ciocalteu 显色剂的配置［11］

称取50．0 g钨酸钠和12．5 g钼酸钠，用350 mL蒸馏水溶于1 000 mL回流瓶中，加入25 mL磷酸和50 mL浓盐酸，充分混匀，微沸回流10 h;再加入75．0 g硫酸锂，25 mL蒸馏水和数滴溴水，然后开口继续煮沸15 min，使得嗅水完全挥发为止;冷却后定容至500 mL，过滤，滤液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中保存备用。此液在冰箱中可长期保存，使用时加入1倍体积的蒸馏水稀释即可。

1．2．3．2 提取液中总多酚含量的测定

移取待测提取液1 mL于10 mL容量瓶中，依次加入1 mL Folin－Ciocalteu显色剂，摇匀后加入2 ml 15%Na2CO3溶液定容到10 mL，室温下反映2 h后测定A760。以没食子酸作标样，制标准曲线，得回归方程为 y=0．068 7x－0．000 4，其中 y为没食子酸含量，x为吸光度，R2=0．999 0，具有良好的线性关系。根据标准曲线计算总多酚的没食子酸当量，总酚含量以每100 g小米粉的没食子酸当量(mg)表示。

1．2．4 大孔吸附树脂对小米多酚的静态吸附试验

分别称取预处理后的各树脂2．0 g(用滤纸吸干)置于锥形瓶中，准确加入30 mL小米多酚粗品溶液，避光密封，置气浴恒温振荡器中，于20℃、180 r/min条件下振荡，定时从上清液中取样，检测多酚含量的变化，按公式(1)、公式(2)计算静态吸附量和静态吸附率，并绘制吸附曲线。

式中:Q1为吸附量/mg/g;Q2为吸附率/%;c0为吸附前供试液中小米多酚的质量浓度/mg·mL－1;c1为吸附后供试液中小米多酚的质量浓度/mg·mL－1;V1为供试液的体积/mL;m为树脂湿重/g。

1．2．5 静态解吸试验

分别将上述充分吸附了小米多酚溶液的树脂进行过滤，再将其置于锥形瓶中，加入体积分数为70%乙醇溶液40 mL，封口，置气浴恒温振荡器中，于20℃、180 r/min条件下振荡，24 h后从上清液中取样，检测多酚含量，由公式(3)计算静态解吸率。

式中:P1为解吸率/%;c2为解吸液中小米多酚的质量浓度/mg·mL－1;V2为解吸液体积/mL。

1．2．6 动态吸附试验

通过各种大孔树脂对小米多酚的静态吸附试验，对筛选出一种理想的树脂进行动态吸附试验，将该树脂装入(16×700)mm玻璃层析柱中，柱床体积为60 mL，将一定浓度的小米多酚提取物上柱，控制上柱流速，分步收集流出液(5 mL/管)，并检测每单位流出液的小米多酚浓度，当流出液吸光度达上样液的1/10时，认为小米多酚已透过，停止上样，计算吸附量。

2 结果与讨论

2．1 大孔吸附树脂对小米多酚类物质的静态吸附

4种树脂对小米多酚的吸附与解吸结果见表2、图1。

表2 4种树脂对小米多酚的吸附与解吸

从表2中可以看出各树脂对小米多酚的静态吸附总量相差较大，4种大孔树脂对小米多酚的吸附量的顺序依次是:AB－8＞DM－130＞DM－301＞NKA－9，这是因为小米多酚含有多酚结构，具有弱极性，AB－8、DM－130均为弱极性树脂，一般弱极性吸附树脂是含酰基的吸附树脂，其表面兼有疏水和亲水两部分，既可由极性溶剂中吸附非极性物质，又可由非极性溶液中吸附极性物质［12］。因此较其他2种树脂对小米多酚的吸附量大;而4种树脂均具有较好的解吸率，都达到80%以上。

从图1中可以看出，4种树脂对小米多酚的吸附均为快速平衡型，起始阶段吸附量都较大;且树脂的吸附速率随时间的增加而急剧下降，然后慢慢趋向饱和。10 h后均基本达到平衡，从总体上看AB－8型树脂的吸附量始终优于另外3种树脂。

图1 各树脂对小米多酚的静态吸附曲线

因此，综合考虑各树脂对小米多酚的吸附率和解吸率，选取AB－8型大孔树脂作为吸附分离小米多酚的树脂。

2．2 AB－8型树脂对小米多酚类物质的动态吸附

2．2．1 动态吸附性能曲线的测定

为进一步了解AB－8型树脂对小米多酚的吸附特性，进行动态吸附试验，结果如图2所示。从图2可以看出，AB－8大孔树脂对小米多酚具有良好的动态吸附性能，可处理2倍于柱体积的样品溶液而无泄漏，并在较长的一段时间内保持低浓度泄漏。

图2 AB－8型树脂对小米多酚的动态吸附曲线

2．2．2 上柱速率对吸附率的影响

控制上柱速率分别以 1、2、3、4、5 mL/min 的流速通过层析柱，以5 mL为单位收集流出液，并检测每单位流出液的小米多酚浓度(当流出液中多酚浓度达到上柱液浓度的1/10时停止上样)，以上柱速率与动态吸附率作图，考察上柱速率对AB－8大孔树脂吸附小米多酚的影响，结果如图3。

图3 上柱速率对吸附率的影响

随着上柱速率的增加，AB－8型树脂对小米多酚的吸附率逐渐减小，当上柱速率为1 mL/min时，其动态吸附率为 67．62%，当上柱速率提高到5 mL/min时，其动态吸附率降至58．28%。因为多酚类化合物是一类大分子化合物，其扩散速度较慢，在较低的流速下，多酚类化合物有充分的时间进行膜扩散和颗粒内扩散，有利于提高树脂的吸附量。如果上柱流速过大，则大量多酚类化合物还来不及被树脂充分吸附便流出树脂柱，树脂的利用度大大降低。虽然较低的流速有利吸附的进行，但流速过低，操作时间又会延长。因此综合考虑吸附率和生产效率，以上柱速率2 mL/min效果最佳。

2．2．3 样液pH对吸附率的影响

量取不同pH的上样液各100 mL，以2 mL/min的流速通过层析柱，以5 mL为单位收集流出液，并检测每单位流出液的小米多酚浓度(当流出液中多酚浓度达到上柱液浓度的1/10时停止上样)，计算吸附率。考察上样液pH对AB－8大孔树脂吸附小米多酚的影响，结果如图4。

图4 上样液pH对吸附率的影响

在其他条件相同的情况下，上样液的pH对小米多酚的吸附率有一定影响。小米多酚由于其具有多酚结构，显弱酸性，因而，要达到较好的吸附效果，必须在弱酸或酸性条件下吸附。经测定，小米多酚粗提液的pH为4左右，而且比较稳定。

2．2．3 上样液质量浓度对吸附率的影响

量取不同浓度、pH 4．20的上样液各100 mL，以2 mL/min的流速通过层析柱，以5 mL为单位收集流出液，并检测每单位流出液的小米多酚浓度(当流出液中多酚浓度达到上柱液浓度的1/10时停止上样)，计算吸附率。考察上样液质量浓度对AB－8大孔树脂吸附小米多酚的影响，结果如图5。

图5 上样液质量浓度对吸附率的影响

上样液质量浓度较低时，随浓度的增大，吸附量也增大，当上样液质量浓度达到0．12 mg/mL时，吸附率略有下降，因此，上样液质量浓度在0．12～0．14 mg/mL范围内较合适。因为随着多酚浓度的提高，与多酚竞争吸附的杂质量也随之增加，加之流速恒定后，随着料液浓度增加，可能使多酚等物质在树脂内部扩散能力降低。

2．2．5 洗脱剂用量的选择

图6 洗脱剂用量的选取

洗脱剂用量的选择结果见图6，当收集到2BV(柱床体积)，即洗脱溶剂为120 mL时，小米多酚的洗脱率达到90%以上。洗脱剂用量过多，会造成乙醇的浪费，同时也为后续浓缩过程带来一定的困难。因此，选取洗脱溶剂用量为120 mL即2BV。

2．2．6 洗脱剂流速对洗脱率的影响

量取浓度一定的上样液100 mL，以2 mL/min的流速通过层析柱，吸附饱和后，分别用70%的乙醇以 0．5、1、1．5、2、2．5 mL/min 的流速洗脱，分步收集(每5 mL收集一次)乙醇洗脱液，并检测每单位流出液的小米多酚浓度，计算解吸率，考察洗脱剂流速对洗脱率的影响。不同洗脱速率下的洗脱曲线见图7、图8。

洗脱速度是影响树脂吸附分离特性的一个重要因素。在解吸过程中，洗脱速度一般都比较慢，因为流速过快，洗脱性能差，洗脱带宽，且拖尾严重，洗脱不完全;而流速过慢，又会延长生产周期，导致生产成本提高。从图7可以看出，当洗脱剂的流速为0．5、1 mL/min时，洗脱峰相对集中，无明显拖尾现象;当洗脱剂的流速为 1．5、2、2．5 mL/min时，虽然出峰较快，但洗脱带宽，洗脱效果不太理想。因此，结合图7、图8，选择1 mL/min洗脱速率为宜。

2．2．7 乙醇体积分数对洗脱率的影响

量取浓度一定的上样液100 mL，以2 mL/min的流速通过层析柱，吸附饱和后，分别用体积分数为10%、30%、50%、70%、90%的乙醇水溶液及无水乙醇以1 mL/min的流速洗脱，分步收集(每5 mL收集一次)乙醇洗脱液，并检测每单位流出液的小米多酚浓度，计算解吸率，考察乙醇体积分数对洗脱率的影响，结果如图9、图10。

从图9可看出，当洗脱液的体积分数为70%时，洗脱峰相对集中，无明显拖尾现象;而体积分数为10%的乙醇溶液对AB－8型大孔树脂吸附的小米多酚没有解吸效果，当洗脱液用量为200 mL时，仍未检测出小米多酚。这说明小米多酚具有一定的极性。从图10可看出，随着乙醇体积分数的增加，洗脱率逐渐增大，当乙醇体积分数达到70%时，洗脱率已达到95%，后随乙醇体积分数的继续增加，洗脱率逐渐减小。因此，结合图9、图10，选择体积分数为70%的乙醇溶液作为洗脱剂。

3 结论

通过静态吸附、解吸试验表明:AB－8型树脂是一种分离纯化小米多酚类物质理想的树脂，其吸附量为0．333 0 mg/mL，吸附率为 40．15%，解吸率为83．33%。

通过动态吸附、解吸试验得到AB－8型树脂分离纯化小米多酚类物质的最佳工艺条件，吸附过程:上样流速2 mL/min，上样液质量浓度为0．12～0．14 mg/mL，上样液pH 4左右;洗脱过程:以70%的乙醇为洗脱剂，洗脱流速为1 mL/min。

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Purification Process of Polyphenol Compound from Foxtail Millet by Macroporous Resins

Wang Ruolan Tian Zhiqin Kong Xianggang Li Dongling
(College of Food Science and Engineering，Henan University of Tech－nology，Zhengzhou 450052)

In order to separate and purify polyphenol compound from foxtail millet，four types of macroporous resin were selected to compare their performances in absorbing and desorbing polyphenol compound from foxtail millet，the optimal absorbent material for polyphenol compound from foxtail millet was decided and its dynamic absorbing behavior was studied in this paper．The results showed that AB －8 resin possessed a higher absorption and desorption capacity and the optimal technological conditions of adsorption velocity was 2 mL/min，solution pH was about 4，solution concentration was 0．12 mg/mL to 0．14 mg/mL and the eluting solvent was 70%ethanol at 1 mL/min flow rate．

foxtail millet，polyphenol compound，macroporous resins，purification

TS202．1

A

1003－0174(2011)10－0035－06

2010－12－18

王若兰，女，1960年出生，教授，硕士生导师，粮食储藏及品质控制