HPLC法测定山绿茶中芦丁的含量

刘 浩，康建党，李建勋，卢鹏伟

（1.河南省健康伟业医药科技有限公司，河南 郑州450000；2.河南省医药技师学院，河南 开封475003）

山绿茶为冬青科植物海南冬青（Ilex hainanensis Merr.）的干燥叶，主要分布于广西、广东一带。山绿茶为广西少数民族民间中草药，使用历史悠久，已收载于《广西中药材标准》（1990版）［1］。山绿茶具有清热解毒、消肿止痛、活血通脉的功效，主要用于降血压［2］、降血脂、降胆固醇，也用于冠心病、脑血管意外所致的偏瘫以及风热感冒、肺热咳嗽、咽喉水肿、扁桃体炎、痢疾等病症的治疗。山绿茶降压片标准中，只有2项鉴别，无含量测定项目。为定量控制药材质量，以主要有效成分芦丁作为指标，建立反相高效液相色谱测定法测定山绿茶药材的含量。实验结果表明，本方法稳定、可靠、精密度高，适合于山绿茶药材的质量定量控制。

1 实验部分

1.1 仪器设备

Lab Alliance PC-4000高效液相色谱仪；Model 500紫外检测器；Model LA-100柱温箱；CBM-102色谱工作站（Shimadzu）。

1.2 药品与试剂

乙腈为色谱纯（德国Merk公司）；水为纯化水；试剂、试药均为分析纯；芦丁对照品（批号为100080-200306，供含量测定用，购自中国药品生物制品检定所）。

2 含量测定

2.1 色谱条件与系统适用性实验

色谱柱：Waters公司C18柱4.6mm×250mm，5μm；流动相：乙腈－体积分数为2.5%醋酸溶液（15∶85）；检测波长：254nm；流速：1.0mL／min；理论板数按芦丁峰计算应不低于2 500；芦丁主峰与前后相邻2峰的分离度不得小于1.5。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品适量，加甲醇制成0.1g／L的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备方法研究

芦丁溶于热甲醇及乙醇中［3］，为选择合适的提取溶媒与提取方法，取同批山绿茶药材粗粉1g，精密称定，共取4份，2份加甲醇50mL，另2份加乙醇50mL，置锥形瓶中，分别按照表1提取方法提取、滤过，用甲醇适量分次洗涤容器与滤渣，洗液以同一滤器滤过，滤液合并、蒸干，残渣用甲醇溶解并移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液，作为供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，按外标法计算芦丁的含量，结果见表1。

表1 不同溶媒超声及回流提取测定结果

结果表明，甲醇提取所得结果高于乙醇提取，热回流提取结果比超声提取结果高。因此，选择甲醇作为溶媒，加热回流，提取制备供试品溶液。

为选择合适的提取时间，同上述方法，分别加甲醇后提取0.5、1.0、1.5、2.0h，依照上述方法制备成供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪测定，按外标法计算芦丁的含量，结果见表2。

表2 不同提取时间芦丁含量测定结果

由此可见，甲醇回流1h可基本将样品中的芦丁完全提取。因此，确定本品芦丁含量测定方法为：取山绿茶粗粉1g，精密称定，加甲醇50mL，加热回流1h，滤过，用甲醇适量分次洗涤容器与滤渣，洗液以同一滤器滤过，滤液合并，蒸干，残渣用甲醇溶解并移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液进行进样分析。

2.4 线性关系考察

称取芦丁对照品22.91mg，置25mL量瓶中，加甲醇超声溶解，甲醇至刻度，摇匀。分别精密量取对照品溶液0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。分别精密吸取上述溶液各20μL，注入液相色谱仪中，在上述色谱条件下测定芦丁峰面积。浓度分别为0.018 33、0.054 98、0.091 64、0.128 30、0.165 00、0.183 30g／L，对应峰面积分别为680 192、2 069 645、3 399 468、4 652 477、6 095 039、6 772 013。以对照品溶液浓度为横坐标，以芦丁峰面积积分值为纵坐标，制得标准曲线，回归方程为：A＝3.673×107C＋1.745×104，r＝0.999 8，标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线图

2.5 精密度实验

取同批山绿茶制成的供试品溶液，在上述色谱条件下，连续进样5次，每次20μL，测定芦丁峰面积，并计算5次测定结果的相对偏差。5次进样峰面积分别为3 191 891、3 195 683、3 233 968、3 201 731、3 146 478，平均峰面积为3 193 950，RSD为0.98%。实验结果表明，方法精密度较好。

2.6 稳定性实验

精密吸取同批山绿茶制成的供试品溶液20μL，注入液相色谱仪，测定芦丁峰面积，并随后每隔一定时间再次精密吸取20μL，依法操作，测定芦丁峰面积，直至24h。结果表明，供试品溶液中的芦丁在24h内基本稳定，见表3。

表3 山绿茶芦丁含量测定稳定性实验结果

2.7 重复性实验

取同批山绿茶药材粗粉5份，每份1g，精密称定，依法制成供试品溶液，进样操作测定，计算芦丁含量及测定的相对标准偏差。5次测定药材粗分含量分别为0.048 3%、0.047 8%、0.048 9%、0.048 1%、0.047 9%，平均值为0.048 2%，RSD为0.90%。结果表明，方法重复性较好。

2.8 加样回收实验

取上述已测定含量的山绿茶粗粉0.5g，精密称定，分别加芦丁对照品溶液（0.402g／L）0.5、0.6、0.7mL，待溶剂挥发干以后，依法制成供试品溶液，测定，计算回收率。实验结果表明，回收率较好，见表4。

2.9 日间精密度实验

取批号为050712的山绿茶药材内容物2份，每份1g，精密称定，依法制成供试品溶液，进样操作测定。连续5d同法操作测定，分别计算每天测定的每粒胶囊中芦丁的含量及5d测定的相对标准偏差。第1、2、3、4、5 天 测 得 含 量 分 别 为 0.045 9%、0.045 3%、0.046 1%、0.045 4%、0.046 0%，平均含量为0.045 7%，RSD为0.79%。结果表明，方法精密度较好。

2.10 10批山绿茶药材芦丁含量测定

取10批山绿茶样品，分别依法测定，同时另取本品粗粉测定水分［4］，按干燥品计算含量，芦丁含量在0.044 8%～0.060 3%之间。因此，将山绿茶药材芦丁含量定为按干燥品计算，不得少于0.044%，结果见表5。

表4 山绿茶芦丁含量测定加样回收实验结果

表5 山绿茶药材中芦丁含量测定结果（%）

3 讨论

3.1 流动相选择

根据芦丁的极性大小，并参考有关文献［5－6］，选择甲醇－水－冰醋酸（40∶57.5∶2.5）、甲醇－乙腈－水－冰醋酸（30∶10∶57.5∶2.5），乙腈－体积分数2.5%醋酸（15∶85）3种不同的流动相体系，考察芦丁出峰时间、与临近峰分离度、理论板数等分离情况。结果显示，乙腈－体积分数2.5%醋酸为流动相的峰形对称性、理论板数以及样品的分离度均明显优于其他2个体系。

3.2 检测波长的选择

取芦丁对照品适量加甲醇制成0.1g／L的溶液，用分光光度法测定溶液在254nm与358nm的波长处有最大的吸收，在高效液相色谱仪上采用双波长检测器检测，当检测波长在254nm时，峰面积较大，故以254nm为检测波长。

3.3 提取溶剂及时间的选择

由于芦丁溶于热甲醇及乙醇，故在选择供试品溶液的制备方法时，对提取溶媒、提取方法及提取时间进行了考察，结果表明，采用甲醇回流1h可基本将样品中的芦丁提取完全。

［1］广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准［S］.南宁：广西科学技术出版社，1990：137－138.

［2］陈一.山绿茶的降压作用［J］.中草药，1983，14（4）：27－30.

［3］许海琴，许列琴，许江苇，等.常用天然提取物质量标准参考手册［M］.北京：化学工业出版社，2003：129－130.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.北京：中国医药科技出版社，2010：附录IXH.

［5］文东旭，郑学忠，井上谦一郎，等.海南冬青的化学成分研究［J］.中国中药杂志，1999，24（4）：223－225.

［6］赵登飞.HPLC测定山绿茶胶囊中芦丁的含量［J］.中成药，2002，24（9）：724－725.