不同ω-3/ω-6构成比的配伍红花籽油对SH-SY5Y细胞氧化损伤的预防效应

吴 迪，吴桂荣，阿布力孜·阿布杜拉，盛 磊，巴哈尔古丽·卡哈尔*

1新疆医科大学药学院药化有机教研室; 2新疆医科大学新疆地方病分子生物学重点实验室，乌鲁木齐830011

不同ω-3/ω-6构成比的配伍红花籽油对SH-SY5Y细胞氧化损伤的预防效应

吴 迪1，吴桂荣1，阿布力孜·阿布杜拉2，盛 磊2，巴哈尔古丽·卡哈尔1*

1新疆医科大学药学院药化有机教研室;2新疆医科大学新疆地方病分子生物学重点实验室，乌鲁木齐830011

探讨不同ω-3/ω-6构成比的配伍红花籽油(Compatibility Safflower Seed Oil，CSSO)预防神经细胞氧化损伤的作用。通过过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)氧自由基供体诱导，建立人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞氧化损伤模型;以不同浓度和ω-3/ω-6构成比的CSSO进行细胞药物干预，利用四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)和流式细胞仪检测细胞活力变化和细胞凋亡率。我们建立了H2O2诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤模型，其IC50值为1089.54 μmol/L H2O2;随着ω-3相对含量递减，CSSO预防细胞氧化损伤的效应增加，且当ω-3/ω-6比例为1∶6.68和有效浓度范围为375～750 μg CSSO/mL时，其药物干预组细胞活力(84.1%)显著高于模型组(61.1%)，而药物干预组细胞凋亡率(12.6%)明显低于模型组(25.9%)。从以上结果可以推测，CSSO能够保护细胞并预防氧自由基诱导的细胞损伤，其效果可能与CSSO中ω-3/ω-6构成比密切相关。

配伍红花籽油;氧化损伤;SH-SY5Y;MTT

配伍红花籽油(Compatibility Safflower Seed Oil， CSSO)是由新疆地产红花籽油与胡麻油皂化产物混酸以一定的比例配伍而成的创新配伍使用油，主要有效成分为ω-3、ω-6多不饱和脂肪酸。以往的研究证实，CSSO具有降血脂［1］、防止动脉粥样硬化、抗凝血、防止血栓形成等药理作用［2］。此外，CSSO对于脑、视网膜、神经组织发育具有一定的调节作用［3］。本研究拟建立H2O2诱导的神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)氧化损伤模型，以原料红花籽油(Safflower Seed Oil，SSO)，混酸(Mix-Polyunsaturated fatty acid，Mix-PUFA)及不同ω-3/ω-6构成比的CSSO干预细胞，研究CSSO保护神经细胞并预防自由氧基引起的细胞氧化损伤的效应，为更好的利用新疆红花资源和新药研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

SH-SY5Y细胞由中国科学院上海分院细胞库提供。D-MEM/F12培养基、胎牛血清(GIBCO公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT)、抗菌素、胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)、磷酸平衡盐(PBS)(Sigma和Invitrogen公司);Annexin V-FITC试剂盒(Calbiochem公司);细胞培养所需的低值易耗品来自Corning或Exogen公司。不同比例配伍红花籽油由新疆医科大学药学院药化有机教研室红花课题组提供。CO2孵育箱(HERA cell 150，Thermo公司);生物安全柜(KS18，Thermo公司);倒置显微镜(BH-2，Olympus公司);台式离心机(3-18K，Sigma公司);酶标仪(AD 340，Beckmann Coulter);流式细胞仪(LSRⅡ，BD公司)。

1.2 细胞培养

配制含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的D-MEM/F12养基，在5%CO2和37℃条件下培养SH-SY5Y细胞，每隔1 d更换一次培养基，待细胞融合度达80%～90%时，用胰蛋白酶(0.25%)消化法以1∶2的比例传代。

1.3 不同ω-3/ω-6构成比的CSSO母液制备

以1∶4比例(v/v)将CSSO溶于DMSO，配制0.25 g/mL的CSSO母液，并在使用时，用D-MEM/ F12完全培养基稀释药物至所需浓度(培养基中DMSO终浓度约为0.7%)。

1.4 MTT法检测细胞活力

取对数生长期的SH-SY5Y细胞，接种于96孔板(密度为3×105个/mL)，每孔200 μL，按预定浓度进行各种药物或试剂(CSSO、H2O2)干预后，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，并换成等体积的无血清培养基。在37℃和5%CO2细胞孵育箱培养4 h后，弃去培养基，加入150 μL DMSO，待细胞内紫色结晶溶解后，利用酶标仪测定其570 nm处吸光度值(OD值)，并判断细胞活力。细胞活力及抑制率分别按以下公式计算:

1.5 细胞凋亡率的流式细胞仪检测

选择对数生长期的SH-SY5Y细胞，以4×106个/mL的密度种植于25 cm2培养瓶，每瓶1 mL，培养20～24 h后进行药物干预。待所有药物干预过程完成后，收集细胞，参照Annexin V-FITC试剂盒说明书处理细胞，并于流式细胞仪测定细胞凋亡率，主要步骤包括:细胞悬浮、结合Annexin V-FITC(1.25 μL)和碘化丙啶(PI，10 μL)，以及流式细胞仪检测。流式细胞仪分析条件:激发波长Ex=488 nm;发射波长Em=530 nm。

1.6 统计分析

用SPSS16.0统计软件进行统计分析，结果用均数±标准差表示。对数据进行正态性、方差齐性检验，若同时满足正态性、方差齐用单因素方差LSD进行组间比较，若方差不齐则用Dunnett T3检验，检验水准为α=0.05，P≤0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 H2O2诱导及SH-SY5Y细胞活力的变化

表1 浓度梯度H2O2对细胞活力的影响Table 1 Influence of H2O2on growth and viability of SH-SY5Y cells in different concentration

2.2 CSSO对H2O2诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤的影响

由于CSSO是脂溶性化合物，进行细胞药物干预需要适当的有机溶剂。我们选择DMSO为溶剂，经细胞毒性试验，确定其安全浓度范围为0～2%。通过细胞毒性实验，设定各配伍比例的用药浓度范围。

分别设置浓度梯度的Mix-PUFA(ω-3/ω-6 1∶0.25)、SSO(ω-3/ω-6 0∶1)、CSSO 1(ω-3/ω-6 1∶1.18)、CSSO 2(ω-3/ω-6 1∶6.68)、CSSO 3(ω-3/ω-6 1∶16.1)，预干预细胞24 h，1000 μmol/L H2O2诱导3 h后，MTT结果显示(表2)，Mix-PUFA在25～100 μg/mL浓度范围内，与模型组相比细胞活力基本无变化(P＞0.05)，提示其对SH-SY5Y细胞的氧化损伤基本无预防作用;SSO在187.5～375 μg/mL浓度范围内时，可维持SH-SY5Y细胞活力在79.04～80.27%之间，有统计学意义(P＜0.05)。浓度高于375 μg/ mL时细胞活力开始下降，可能因其对细胞产生一定的毒性所致。

CSSO 1浓度增加保护作用增强，在60～240 μg/mL浓度范围内与模型组(68.67%)相比，细胞活力先升高后降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，120 μg/mL时细胞活力最大(84.62%)。浓度高于120 μg/mL时，细胞活力开始下降，提示可能出现细胞毒性，预防程度与SSO相比稍有增强，但有效浓度范围与SSO相比减小。CSSO 2在187.5～1125 μg/mL浓度范围内可有效保护细胞，与模型组相比(61.17%)有统计学意义(P＜0.01)。在187.5～750 μg/mL的浓度范围内，浓度增加预防作用增强，750 μg/mL时，细胞活力最大(84.14%)，高于750 μg/mL时细胞活力开始下降，但程度不明显，提示可能因细胞毒性或实验误差所致。CSSO 2预防细胞氧化损伤的作用与SSO及CSSO 1相比增强，与CSSO1相比有效浓度范围增加，与SSO相比缩小，对细胞的保护程度相对最佳。

CSSO 3在175～2000 μg/mL浓度范围内随着浓度增加，预防细胞氧化损伤的作用增强，与模型组(68.16%)相比，有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，2000 μg/mL时，细胞活力最大(85.83%)其有效范围与SSO相近，但程度有所增强。与SSO、Mix-PUFA及其它CSSO相比预防细胞氧化损伤的有效浓度范围最宽，但保护的程度与CSSO 2相比较弱。综合评价CSSO 3预防细胞损伤的效果优于CSSO 1、Mix-PUFA、SSO，但低于CSSO 2。相关性分析结果表明，SSO、Mix-PUFA及CSSO对SH-SY5Y细胞的预防作用均不存在剂量-效应线性相关性。

表3 CSSO预干预后，氧自由基引起的SH-SY5Y细胞活力变化Table 3 The cell viability change of SH-SY5Y after the treatment of CSSO

2.3 流式细胞技术检测CSSO 2预干预后，对SHSY5Y细胞凋亡率的影响

根据MTT实验结果，选择预防氧化损伤综合效果较好的ω-3/ω-6构成比，即CSSO 2(ω-3/ω-6，1∶6.68)，进一步研究揭示CSSO 2预防氧自由基诱导的细胞凋亡的作用。CSSO 2预干预24 h，H2O2诱导3 h后，用Annexin V-FITC/PI荧光染色剂染色后，流式细胞仪检测细胞凋亡率(图1)。正常生长的细胞几乎没有发生细胞凋亡(0.8%)，而模型组细胞凋亡率达25.9%(图1，B)。经CSSO 2(375和750 μg/mL)预干预后，细胞凋亡率分别下降至12.6%和13.6%，(图1中C和D)。与MTT实验所得结论基本吻合，说明CSSO 2在此浓度时，可有效预防氧自由基诱导的细胞凋亡。浓度为1125 μg/mL时细胞凋亡率与模型组相比有所增加，与MTT结果不完全吻合，可能大剂量使用时该浓度体现出细胞毒性。

图1 CSSO 2干预后，对氧自由基引起SH-SY5Y细胞凋亡率的影响Fig.1 The effects of apoptosis rates cause by oxygen free radical after the treatment of CSSO 2

3 讨论

近年来，研究发现阿尔茨海默氏症、老年痴呆等多种神经退行性疾病(Neurodegenerative Diseases，ND)的发生与活性氧的介入密切相关，活性氧的产生及其对生物大分子的损伤机理研究受到各领域的普遍重视［4］。

CSSO主要生理活性成分为ω-3、ω-6系列多不饱和脂肪酸α-亚麻酸和亚油酸。据已有研究报道，α-亚麻酸和亚油酸在细胞内代谢转变成DHA、EPA、ARA等二十烷类衍生物，在体内发挥重要的生理作用。α-亚麻酸的代谢产物DHA是视网膜及神经系统细胞膜的主要组成成分，可提高神经细胞的生存能力及传导能力［5］，增加细胞膜的流动性，作用机理尚未查证。

本研究选择SH-SY5Y细胞作为神经细胞的模型，以H2O2为刺激源，建立了SH-SY5Y细胞氧化损伤模型，并以二甲基亚砜(DMSO)为脂溶性CSSO的溶剂，对细胞进行预干预。MTT结果显示，配伍红花籽油2(CSSO 2)预防细胞氧化损伤作用相对最好，在187.5～1125 μg/mL浓度范围内有效。流式细胞技术检测细胞凋亡率提供了更客观的依据，进一步确定最佳有效预防细胞氧化损伤的浓度范围为375～750 μg/mL。

由实验结果可知，混酸(Mix-PUFA)细胞毒性较大，配伍红花籽油3(CSSO 3)在保证一定的细胞存活率的前提下，有效浓度范围相对较宽(175～2000 μg/mL)。提示，配伍红花籽油(CSSO)中ω-3的相对量，对预防细胞氧化损伤起决定性作用，其浓度相对较低时，可提高CSSO的有效浓度范围，但保护程度降低，当其含量达到某一值时(ω-3/ω-6 1∶6.68)虽然有效浓度范围缩小，但对细胞氧化损伤的保护效果提高约10%，由此推测CSSO对氧化损伤引起的ND可能有潜在的预防作用，且这种作用可能与ω-3和ω-6的比例直接相关。由MTT实验可知，CSSO对细胞氧化损伤的预防效果明显优于配伍原料SSO和Mix-PUFA，充分体现了配伍使用的优越性。

目前，治疗ND的药物以胆碱酯酶抑制为主，该类型的药物存在半衰期短、较严重的外周胆碱能系统副作用、肝毒性等缺点，临床应用前景受到限制［6，7］。因此，对ND治疗药物的研究，逐渐转向天然抗氧化活性物质的开发。通过本研究，我们可认为一定ω-3、ω-6构成比的配伍红花籽油具有预防氧自由基诱导的细胞损伤(凋亡)的效应，有作为天然预防ND的抗氧化活性物质开发的潜力，为新疆红花药用资源的开发与利用提供理论依据。

1Wu GR(吴桂荣)，Mao XM(毛新民)，Wang Y(王岩).Effect of safflower oil emulsion on lipid lowing.Chin J New Drug，2003，12(2):111.

2 Zhang YR(张艳荣)，Zhang YY(张雅媛)，Li Y(李玉).Anti-thrombosis action of Agaricus blazei Murrill ω-6 polyunsaturated fatty acid on rats and mice.J Jilin Univ(Med Ed)，2006，32:774-776.

3 Xu ZH(徐章华)，Shao YF(邵玉芬).Effects of α-linolenic acid on rats`behavior，retina and liver，brain fatty acid composition.China Public health，2002，18:301-303.

4 Mandem akers W，Morais VA，De Strooper B.A cell biological perspective on mitochondrial dysfunction in Parkinson disease and other neurodegenerative disease.J Cell Sci，2007，(10):1707-1716.

5 Chalon S，Vancassel S，Zimmer L，et al.Polyunsaturated fatty acids and cerebral function:focus on monoaminergic neurotransmission.Lipids，2001，36:937-944.

6 Rogers SL，Farlow MR，Doody RS，et al.A-4-week，doubleblind，placebo-control ledtrial of donepezilin patients with Alzheimer’s disease.Neurology，1998，50:136.

7 Lim GP，Chu T，Yang F，et al.The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse.J Neurosci，2001，21:8370-8377.

Preventive Effect of Different ω-3/ω-6 Constituent Ratio of Compatibility Safflower Seed Oil on SH-SY5Y Cells against Oxidative Cell Damage

WU Di1，WU Gui-rong1，Abulizi ABUDULA2，SHENG Lei2，Bahaerguli KAHAER1*1Department of Pharmacochemistry and Organic Chemistry，College of Pharmacy，Medical University of Xinjiang;2Xinjiang Key Laboratory of Molecular Biology and Endemic Diseases，College of Preclinical Medicine，Medical University of Xinjiang，Urumqi 830011，China

In order to investigate the preventive effect of different ω-3/ω-6 constituent ratio of compatibility safflower seed oil(CSSO)on SH-SY5Y human neuroblastoma cells against oxidative cell damage，an oxidative cell damage model was established by using hydrogen peroxide(H2O2)as a donor of free reactive oxygen species，and after treatment of cells with different ω-3/ω-6 constituent ratios of CSSO，the alteration of cell viability and cellular apoptosis were determined by MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)assay and flow cytometry.We successfully established the oxidative cell damage model of SH-SY5Y cells induced by H2O2，with the IC50value of 1089.54 μmol/L H2O2.The preventive effect of CSSO against oxidative cell damage increased along with the decreasing amount of ω-3 content in CSSO.Moreover，at the ω-3/ω-6 ratio of 1:6.68 and effective dose range of 375-750 μg/mL CSSO，the cell viability was increased significantly to a higher level in the treatment group(84.1%)than in the control(61.1%)，and cellular apoptosis was decreased markedly to a lower level(12.6%)in treatment group than in the control(25.9%).The results suggested that CSSO was able to protect the cells and prevent from oxidative cell damage caused by reactive oxygen species，and this effect may be closely associated with the ω-3/ω-6 constituent ratio in CSSO.

compatibility safflower seed oil;oxidative damage;SH-SY5Y;MTT

1001-6880(2011)03-0420-05

2010-06-22 接受日期:2010-12-06

新疆维吾尔自治区重点实验室基金项目(XJDX0208-2006-07)

*通讯作者 Tel:86-991-4362470;E-mail:bahaerguli_k@126.com

Q946.91;R285

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