病毒诱导的基因沉默

张花美，朱胜男，张丽莎，施曼玲

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

病毒诱导的基因沉默

张花美，朱胜男，张丽莎，施曼玲*

(杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州 310036)

病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)是近年发现的一种转录后基因沉默的现象，是快速鉴定植物基因功能的一种反向遗传学新技术，近年来成为植物基因功能研究的有力工具.文章从病毒诱导基因沉默的发现、作用机制、优势、病毒抑制子及其在植物基因功能研究和植物抗病毒的应用等方面进行了综述.

病毒诱导的基因沉默；机制；病毒载体；病毒抑制子；基因功能

RNA介导的基因沉默(RNA-mediated gene silencing)发生在RNA水平，是一种普遍保守的基于核酸序列的特异性降解机制，并广泛存在于各种生物中，在动物和线虫中称为RNA干涉(RNA-interference, RNAi)，在真菌中称为基因消除(quelling)，而在植物中称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)[1].病毒诱导的基因沉默( virus-induced gene silencing, VIGS)属于转录后的基因沉默，转录后基因沉默(PTGS)是细胞核内转录的mRNA进入细胞质后，由于转入的基因编码区与宿主细胞基因组间存在着同源性，导致转入基因与内源基因的表达同时受到抑制，这种共抑制是PTGS的普遍现象.具有与病毒基因同源序列的转基因植物，在该病毒侵入植物细胞后，可在转录后水平将病毒mRNA降解掉.当不被翻译成衣壳蛋白的病毒mRNA成功克隆到受体植株后，植株具有抵抗该病毒的抗病性，这样人们首次认识到RNA介导的抗病毒性(RNA-mediated virus resistance, RMVR)[2].在此介绍VIGS技术的发现、作用机制、优缺点、病毒载体、病毒抑制子及VIGS在植物基因功能研究和植物抗病毒等方面的应用.

1 病毒诱导基因沉默(VIGS)的发现

早在20世纪20～30年代期间，人们就发现感染了病毒温和株系的植株可以抵御随后的温和株系及与其亲源关系相近的强毒株系病毒的侵染，即交叉保护现象.进一步研究发现，交叉保护现象是由于病毒诱导产生了RNA沉默，使植株产生了对该病毒的抗性，即病毒诱导的基因沉默.后来在转基因植株中出现了类似的现象，即病毒接种的初期，病毒正常增殖，接种叶片表现出被病毒感染的症状.但随着病毒在植株中的系统扩散，植株的新生叶片中虽仅含有少量的转入基因，但表现出对该病毒的抗性[3].1995年，Kumagai 等[4]在烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)中插入了一段八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase,PDS)cDNA片段，PDS是类胡萝卜素合成中的一个关键酶，能保护叶绿素免受光漂白.当带有该cDNA片段的TMV重组病毒载体侵染烟草叶片后，叶片变成白色，其原因是PDS基因发生沉默后，PDS mRNA水平显著降低，导致类胡萝卜素合成途径被阻断，从而使被侵染植物表现出白化效应，可见VIGS可以抑制植物内源基因的表达.近年来随着人们对植物和病毒相互作用机制的进一步研究，VIGS逐渐成为人们用来研究植物基因功能的重要反向遗传学手段.

2 病毒诱导基因沉默(VIGS)的作用机制

图1 病毒诱导基因沉默模型[10]Fig. 1 The model of virus-induced gene silencing in plant

dsRNA是病毒复制过程中的中间体，也是基因沉默的关键诱导起始因子.它可以通过RNA自我复制、病毒复制机制及hpRNA双面克隆转基因等方式产生.dsRNA积累到一定程度后会被类似RNAaseⅢ家族的特异性核酸内切酶Dicer催化降解成21-25nt的小干扰RNA( small interfering RNA, siRNAs). siRNA大体分为2类：一类是从内源的hairpin RNA前体降解而来的21-22nt单链小RNA (micro-RNA，miRNA)[5]，主要负责转录因子、激素因子和沉默相关基因的转录和翻译[6]；另一类是3′端有2nt突出的21-26nt双链小干扰RNA，作用于系统性基因沉默及同源DNA的甲基化[7].RNA基因沉默的代表性特征是siRNAs的产生[8].此后，siRNA在生物体内与RNAase结合形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC，由核酸内切酶、核酸外切酶、解旋酶等组成，对靶mRNA具有识别和切割作用)，siRNA双链解开，带有siRNA的RISC能特异性的识别细胞质中靶基因的miRNA及与之同源的基因，导致靶基因mRNA特异降解，从而导致目的基因在mRNA水平上的沉默[9].还有另外一种可能的情况是：带有siRNA的RISC特异地识别与siRNA高度同源的mRNA序列，并以mRNA为模版，siRNA为引物在RNA聚合酶的作用下合成dsRNA，此双链RNA在下一个循环中被降解掉，是一个级联放大效应(如图1)[10].

3 病毒诱导基因沉默(VIGS)的优缺点

VIGS研究基因组功能的优点在于周期短、成本较低、可在不同的遗传背景下生效，一般从构建重组载体到农杆菌浸润接种植物进行功能鉴定只需几个星期时间，因此既节省时间又节省人力和物力，可以较大规模进行基因组序列的功能鉴定.在筛选植物功能基因上，传统的方法是通过植物表型突变筛选基因.在拟南芥系统上这是一种有效的方法，但周期长、工作量大、过程繁琐，而且依赖于植物遗传转化体系的成熟度.VIGS能够快速用于比较物种间多个基因的功能，例如用TRV-VIGS载体研究MAPK和COLL在番茄抗细菌反应和本氏烟抗病毒反应中的功能[11-14 ].病毒载体的开发促进了VIGS技术的发展，但也有其不足之处，如对VIGS的研究不够深入，许多重要的环节尚处于不明确阶段.另外VIGS的病毒载体有限且有些病毒载体本身也能在植物的生长过程中出现某些症状或在生理上产生一些变化，因此在分析VIGS沉默表型时，要注意这些因素对突变表型的干扰[15].因而进一步了解病毒与宿主的相互作用机制，从更深水平上认识沉默过程中载体与目的基因的变化规律对于VIGS系统在植物基因功能上的研究具有非常重要的意义.

4 VIGS病毒载体

病毒载体已成为动植物表达外源基因的有力工具.据已发表的文章，VIGS病毒载体大致分为RNA病毒载体、DNA病毒载体和卫星病毒载体等3类.VIGS采用的病毒载体多为RNA病毒载体，RNA病毒载体主要有烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)、马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)、烟草脆裂病毒(Tobacco Rattle Virus, TRV)以及大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus, BSMV)等.TMV是最早被应用于VIGS技术的病毒载体，它是双链正义RNA病毒，外壳蛋白亚基呈螺旋对称排列，病毒粒子呈杆状，其N、C末端都暴露在病毒粒体表面.早期TMV病毒载体都通过CP基因置换外源基因，但多数情况下载体不能或仅能较低水平表达外源基因.Kumagai等[16]将另外的病毒CP亚基因组启动子插入TMV基因组，将外源基因插入此启动子下游，但由于载体中双CP亚基因组启动子序列的高频同源重组，导致外源基因极易丢失.PVX是应用于VIGS技术的另一个常用病毒载体，它是单链正义RNA病毒，外壳蛋白由1400个亚基组装而成，其N端的33个氨基酸形成β-折叠暴露在CP表面.1998年Ruiz等[17]以PVX为载体，实现了本氏烟PDS基因沉默.TRV是一种单链RNA病毒，由RNA1和RNA2组成，Ratciff等[18]构建了TRV的RNA1和RNA2 cDNA的双元表达载体，并利用TRV载体成功使转基因烟草的绿色荧光蛋白基因沉默.TRV是一类应用比较广泛而且效率和持久性较好的病毒载体，在介导基因沉默的同时不会带来病毒诱导的症状.此外，Holzberg等[19]利用大麦线条花叶病毒( Barley stripe mosaic virus, BSMV) 首次在单子叶植物大麦上成功抑制了PDS基因的表达, 从而为单子叶植物基因功能的研究提供了有效工具.

5 植物病毒抑制子

病毒抑制子蛋白是一种病毒抑制植物PTGS的反防御因子.植物能通过PTGS抵抗病毒侵染,而病毒可以通过抑制PTGS实现对寄主植物的成功侵染[20].目前已经发现20多种病毒抑制子蛋白[21]，研究比较多的抑制子有HC-Pro、2b和p19.

HC-Pro是一种多功能的蛋白，即作为蚜虫传毒的辅助成分又具有蛋白酶活性.它是最早被发现和研究的沉默抑制子，其N端的2/3部分是蚜传辅助因子，而近1/3部分与相邻的P1蛋白共同行使蛋白水解酶功能，负责加工自身蛋白的C端与P3蛋白N端之间的连接.该蛋白不仅能抑制已经建立的PTGS，同时能抑制21-23nt的小双链(siRNAs)的积累和基因的甲基化；2b蛋白，黄瓜花叶病毒(CMV)的RNA2的亚基因组RNA4编码2b蛋白，该蛋白既是运动蛋白，又是致病因子，并抑制信号的产生与传递，阻止PTGS扩散到新生的组织中，CMV 2b蛋白具有精氨酸富集的核定位信号(NLS) 22 KRRRRR27，另外利用绿色荧光蛋白进行亚细胞定位，结果表明2b蛋白位于烟草植株细胞的核内，显然2b介导的PTGS也发生在细胞核内[22]；P19蛋白，研究较多的是番茄丛矮病毒(TBSV)的P19蛋白, TBSV是正单链RNA病毒，它编码的P19蛋白主要参与病毒的运输，此蛋白在新生叶片的信号传导中起作用.

6 病毒诱导基因沉默(VIGS)的应用

6.1 VIGS技术在植物基因功能研究上的应用

VIGS技术应用的领域越来越广泛，应用最多的是鉴定植物功能基因.如应用于N基因介导的抗性信号途径中关键基因功能的研究[15](见表1).

近年，VIGS主要应用于本氏烟、番茄、拟南芥、烟草、红辣椒、罂粟等作物的植物基因功能研究.研究揭示VIGS在植物体的组织和器官中可诱导目标基因沉默，如TRV载体能够在番茄植株的多个部位产生沉默效果，如叶片、花[23]、果实[24]等.Waterhouse等[25]用PVX载体对合成植物细胞壁纤维素的纤维素合成酶(cellulose synthase genes, CesA)基因进行了研究，结果表明当带有CesA cDNA目的片段的重组载体浸润本氏烟后，细胞壁纤维素的合成能力丧失，并在叶片下表面出现不正常、松散膨胀的球星细胞，同时整个植株出现矮化现象.宋伟杰等[26]利用一种基于PEBV (Pea early browning virus，PEBV) 的VIGS载体诱导研究一个豌豆PI同源基因的功能.豌豆在其PsPI基因沉默后出现了类似拟南芥pi突变体、金鱼草glo突变体的表型，导致其花瓣向萼片以及雄蕊向心皮转变.Wang等[27]将DHS合成酶基因克隆到病毒载体上，利用VIGS将DHS沉默，通过观察其表型突变来研究该基因的功能.另外，2007年，Nagamatsu等通过CMV载体介导基因沉默研究了大豆发育过程中的类黄酮基因的功能.众多的研究表明VIGS技术是研究植物基因功能快速有效的方法，尤其是对于一些转化困难的非模式植物基因功能的研究更为重要.

表1 利用VIGS鉴定植物功能基因Tab. 1 Identification of functional gene in plants by VIGS

6.2 VIGS在植物抗病毒上的应用

植物大多有自己的防御机制，在细菌感染和抗病毒防御机制中，某些基因起着重要作用，克隆这些基因转化到病毒载体上，通过病毒诱导基因沉默的方法，使病毒不能在植物中积累，从而使转基因植物表现抗病毒特性.例如Sainsbury实验室采用病毒诱导基因沉默的方法，从马铃薯中克隆出Rx和Rv两个抗病基因[28-29].这种利用病毒本身基因导入植物从而获得抗病毒植物是植物抗病毒基因工程常用的策略.

7 展 望

VIGS已成为研究基因沉默的热点，同时也是研究植物基因功能和植物抗病毒的一种有力手段.VIGS载体在VIGS技术实施过程中起着重要的作用.2004年以前，最稳定和有效的VIGS载体只在拟南芥、本氏烟和茄科其他物种如番茄上进行分析一些基因的功能；2004年报道了应用于木薯和豌豆等的VIGS载体；2006年后开发了应用于水稻、大豆、玉米等重要经济作物的新载体[30].VIGS也可广泛用于大规模筛选，以鉴定感兴趣的表型和基因序列的功能.随着VIGS作用机制深入研究、病毒载体的不断开发和利用、适用物种的逐渐增多、以及掌握该技术研究人员的不断增加，VIGS将成为基因功能研究和植物功能基因学研究的最有效工具.

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Virus-InducedGeneSilencing

ZHANG Hua-mei, ZHU Sheng-nan, ZHANG Li-sha, SHI Man-ling

(College of Life and Envionmental Science, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Virus-induced gene silencing (VIGS) is a recently discovered post-transcriptional gene silencing. It is a new reverse genetics technique designed to rapidly characterize the functions of plant genes, which is becoming a powerful tool for the study on plant gene functions. The paper reviewed the discovery, mechanism, advantage, viral suppressor of VIGS and its applications in the researches on the plant gene functions as well as the plant virus-resistance.

virus-induced gene silencing; mechanism; virus vector; viral suppressors; gene function

10.3969/j.issn.1674-232X.2011.02.014

2010-07-02

张花美(1985—)，女，山东枣庄人，遗传学专业硕士研究生，主要从事植物病毒与分子生物学研究.

*通信作者：施曼玲(1969—)，女，福建福鼎人，教授，博士，主要从事植物病毒与分子生物学.E-mail: smiling1969@163.com

Q945.8

A

1674-232X(2011)02-0158-05