豚鼠COPD模型MMP-9和TIMP-1的表达及吸入糖皮质激素对其表达的影响

段珊 邓立普

慢性阻塞性肺疾病是以“不完全可逆的气流受限”为特征的慢性气道炎症性疾病。目前认为基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制物(TIMPs)，在COPD发生发展中起重要作用。MMP-9属于MMPs家族中明胶酶类，是降解Ⅳ型胶原的最主要成员之一。而TIMP-1是MMP-9重要的生理性抑制剂。本试验拟检测COPD模型MMP-9和TIMP-1的表达，通过布地奈德干预豚鼠COPD模型的研究，了解其对肺组织MMP-9、TIMP-1表达的影响。

1 材料与方法

1.1 模型制备 健康豚鼠，雌雄对半，体重(200±20)g，共18只，随机分成:(1)COPD模型组12只，分为2小组，每小组各6只，其中一组无药物干预和布地奈德组;(2)正常对照组6只。将三组模型组豚鼠分别放入三个90×60×90 cm(容积486L)自制熏箱内，箱侧壁留有直径约2 cm的通风孔。在通风口处放一小型电扇。豚鼠暴露于烟雾中进行被动吸烟，2次/d，每次10支香烟，持续1～1.5 h，两次被动吸烟间隔4 h，每周被动吸烟5 d，连续3个月。

1.2 药物干预 将布地奈德组豚鼠放入20×30×40 cm塑料箱内，箱侧壁留有直径约1.5 cm的通风孔。布地奈德雾化液通过超声雾化器(由南华大学附属南华医院提供)导入箱内。2次/d，一次加入生理盐水20 ml+布地奈德1 ml(0.5 mg/ml)，雾化时间约30 min。

1.3 病理标本采集及染色 豚鼠断头放血处死，打开胸腔取右下肺及相连的支气管，用生理盐水冲洗肺表面，然后浸入10%福尔马林中固定24 h，取右下肺叶最大横径约3 mm厚组织及支气管分叉上0.5 cm气管横、纵截面标本，脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片。行HE染色和免疫组化。

1.4 免疫组化染色 参照试剂盒推荐链酶卵白素-过氧化物酶免疫组化法，应用SP9003免疫组化试剂盒(中山公司)和DAB显色法。MMP-9、TIMP-1羊多克隆抗体(Santa Cruz美国)1∶100稀释，参照试剂盒操作。

1.5 形态学测量 每张HE切片中随机选择8个视野，应用显微－图像分析系统进行如下指标测量:①肺平均内衬间隔(MLI):其数值反映肺泡平均直径。②平均泡数(MAN):其数值反映肺泡密度。

2 结果

2.1 模型组豚鼠表现 持续吸烟2个月后，模型豚鼠较正常组毛发变黄，呼吸深快，咳嗽，鼻部分泌物较多，饮食及运动情况均较正常组差。

2.2 形态学测量结果 模型组与布地奈德组MLI值明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，反映肺泡平均直径增大;模型组与布地奈德组MAN值明显低于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.01)，反映肺泡密度减少;布地奈德组较模型组，MLI减低，MAN增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 肺组织MLI、MAN结果(±s)

表1 肺组织MLI、MAN结果(±s)

注:*表示与正常对照组比较P＜0.01;#表示与模型组比较P＜0.05

检测指标 正常对照组 COPD模型组模型组 布地奈德组MLI 18.9±1.0 33.6±1.3* 27.4±1.6*#MAN 296.7±18.3 136.3±12.9* 151.2±8.6*#

2.3 MMP-9在肺组织中的表达结果 COPD模型组肺组织MMP-9、TIMP-1均较正常对照组有显著增高(P＜0.01)，差异有统计学意义;布地奈德组MMP-9表达较模型组显著下降(P＜0.05)，而TIMP-1无显著差异。

表2 模型各组与正常对照组肺组织MMP-9、TIMP-1表达结果(灰度值，±s)

表2 模型各组与正常对照组肺组织MMP-9、TIMP-1表达结果(灰度值，±s)

注:*与正常组比较P＜0.01;﹟与模型组比较P＜0.05;△正常组比较P＜0.01

MMP-9 TIMP-1正常对照组组别 例数6 106.7±6.3 114.8±17.4模型组 6 207.3±30.1* 210.1±20.1△布地奈德组 6 164.5±13.0*# 181.0±30.5△

3 讨论

COPD是以不完全可逆的气流受限为特征，由于慢性炎症作用，表现为气道损伤、修复与重塑。本实验通过被动吸烟制备COPD豚鼠模型，病理形态学检查符合COPD表现，模型复制成功。以胶原为主的细胞外基质(ECM)在气道壁的降解沉积失衡是COPD不完全可逆气流受限的重要病理基础。MMP能降解所有ECM的蛋白成分，包括I型胶原和弹力蛋白。同时具有修复ECM、促进细胞迁移、分解细胞因子和激活防御素的作用。过量的MMP可能导致组织损伤。MMP-9属于MMPS家族的明胶类，可以降解细胞外基质和基底膜多种成分。通过一系列基质细胞和COPD发病机制中重要的两种炎症细胞－中性粒细胞和肺泡巨噬细胞所产生。Raulo等［1］对健康的马与患有COPD马的支气管灌洗液中MMP-9比较，发现COPD组马的MMP-9明显高于健康组且与炎性细胞呈正相关。得出结论:MMP-9与COPD的炎症及呼吸道重塑密切相关。而TIMP-1是MMP-9天然的抑制剂，通过与MMP-9酶原及活化形式结合，抑制MMP-9的生物学效应。这两者均可能参与了疾病的发生发展。本实验通过香烟熏吸建立豚鼠COPD模型了解MMP-9、TIMP-1的表达，发现模型组MMP-9、TIMP-1表达均较正常对照组显著增多，这与赵华等［2］研究结果一致。FUNADA 等［3］研究 klotho大鼠，发现MMP-9表达增多，而TIMP-1在肺组织中的表达是减少的。与本实验结果不一致，可能与干预因素不同有关。同时该实验发现klotho大鼠在5周后肺泡腔明显扩大，符合肺气肿病理表现，但肺泡腔内没有炎性细胞渗出和间质纤维化改变。这与本实验模型病理表现不一致，模型肺泡腔内存在大量的炎性细胞渗出。这与本实验通过持续的被动吸烟引起了气道慢性炎症有关。大量的炎性细胞渗出，促进了TIMP-1表达增多。表明慢性炎症的持续存在刺激了MMP-9、TIMP-1分泌，MMP-9、TIMP-1参与了COPD的发生发展。

吸入糖皮质激素与COPD的相关研究已较多，大部分学者支持吸入糖皮质激素在稳定期COPD患者中的使用。本实验欲通过吸入糖皮质激素对COPD的干预，了解激素是否通过对MMP-9和TIMP-1的影响，起到治疗作用，从而为临床治疗提供一定的理论依据。本实验结果显示，布地奈德干预COPD模型后MLI减小，MAN增加，肺气肿有所改善，差异有统计学意义，这与徐凌等［4］的结果相似。但实验中发现MLI、MAN值与正常对照组仍有显著差异，表明吸入糖皮质激素可以改善气道和肺组织重构，却不能完全恢复COPD肺组织病理形态改变。通过药物干预后检测MMP-9、TIMP-1表达，布地奈得组MMP-9表达较模型组有显著降低(P＜0.05)，而TIMP-1表达差异无统计学意义。推测布地奈德可能通过抗炎作用对MMP-9产生一定影响，使肺组织分泌MMP-9减少，进而减少基质的过度降解，改善COPD的组织重塑。表明布地奈得通过干预肺组织中MMP-9的表达，对COPD起到治疗的作用。但布地奈德不能调控TIMP-1的表达。

本实验通过免疫组化的方法检测，可能存在一定的误差，并不能准确反应MMP-9、TIMP-1的变化，下一步可以通过分子水平进行研究，例如应用west blot的方法进行蛋白定量分析。希望本实验的研究对临床COPD治疗应用糖皮质激素有一定理论支持。

［1］Raulo SM，Sorsa T，Tervahartiala T，et al.MMP-9 as a marker of inflammation in tracheal epithelial lining fluid(TELF)and in bronchial-veolar fluid(BALF)of COPD horses.Equine Vet J，2001，33(2):128-136.

［2］赵华，赵瑾，许西琳，等.COPD大鼠模型气道MMP-9和TIMP-1表达的研究.现代生物医学进展，2010，10(12):2244-2246.

［3］Funada Y，Nishimura Y，Yokoyama M，et al.Imbalance of matrix metalloproteinase-9 and Tissue Inhibit of Matirx metalloproteinase-1 is Associated with Pulmonary Emphysema in Koltho mice.Kobe J Med Sci，2004，50(3-4):59-67.

［4］徐凌，蔡柏蔷，朱元珏，等.吸入糖皮质激素对慢性阻塞性肺疾病大鼠模型白细胞介素-4/干扰素γ和基质金属蛋白酶的影响.中国呼吸与危重监护杂志，2004，3(2):86-90.