百草枯降解菌研究初报

高小朋 王海虹 陈彦羽

摘要：试验从长期喷施百草枯的土壤中经富集、筛选，得到４株百草枯降解菌，以生物量为指标， ４株试验菌株在以５．６％百草枯为碳、氮源的培养基中培养３ ｄ时，生长情况明显优于对照组，菌株Ｃ４的生长情况最好，ＯＤ６００达０．２５。

关键词：百草枯；降解；生物量

中图分类号：Ｓ１５４．３ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０11）16－3302-02

Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｐａｒａｑｕａｔ－ｄｅｇｒａｄｉｎｇ Ｓｔｒａｉｎｓ

ＧＡＯ Ｘｉａｏ－ｐｅｎｇ１，Ｗａｎｇ Ｈａｉ－ｈｏｎｇ２，ＣＨＥＮ Ｙａｎ－ｙｕ１

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｙａｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎａｎ ７１６０００，Ｓｈａｎｘｉ， Ｃｈｉｎａ； ２．Ｚｉcｈａｎｇ ｍｉｄｄｌｅ ｓｃｈｏｏｌ， Ｚｉｃｈａｎｇ ７１７３００，Ｓｈａｎｘｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｆｏｕｒ ｓｔｒａｉｎｓ that ｃｏｕｌｄ ｄｅｇｒａｄａｔｅ ｐａｒａｑｕａｔ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｓｏｉｌ where ｓｐｒａｙｉｎｇ ｐａｒａｑｕａｔ for ｌｏｎｇ ｔｉｍｅ，the 4 ｓｔｒａｉｎｓ grew ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｂｅｔｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ５．６％ ｐａｒａｑｕａｔ ａｆｔｅｒ ３ ｈ，ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｃ４ waｓ ｂｅｓｔ，whose ＯＤ６００ ｒｅａｃｈｅｄ ０．２５．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐａｒａｑｕａｔ； ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ； ｂｉｏｍａｓｓ

百草枯是一种双吡啶盐类灭生型触杀性茎叶处理除草剂，又名克无踪、克灭踪等，可用于果园、非种植地、作物行间、免耕田除草，具有广谱、速效、耐雨性强等特点，能杀死大多数单、双子叶杂草，但容易长时间吸附在土壤颗粒上，在土壤中的残留对非靶标的陆上或水生生物有严重危害［１，２］。尤其是对土壤中土著微生物等具有较强的毒害作用，进而破坏土壤的“自净”作用，长期大量使用百草枯所造成的环境污染已不容忽视，而微生物降解是农药降解的主要途径之一，微生物的种类多样、数量繁多，有利于农药的降解［３］。因此，研究百草枯在土壤中的微生物降解，对解决由此造成的环境污染问题具有重要的作用［４］。研究从陕西关中地区使用过百草枯的土壤中驯化筛选出可高效降解百草枯的菌株，为土壤污染的生物修复提供科学依据。

１材料与方法

１．１材料

供试土样：采自陕西省渭南市澄城县善化乡严庄村长期喷施百草枯的果园。培养基［５］：液体富集培养基、基础培养基；供试农药：市售百草枯水剂（浓度２００ ｇ／Ｌ，保定通元精细化工有限公司）。仪器：隔水式电热恒温培养箱（ＰＹＸ－ＤＨＳ－４０×５０－ＢＳ，上海跃进医疗器械厂）、紫外分光光度计（ＵＶ－１２４０，日本岛津）、立式压力蒸汽灭菌锅（ＬＳ－Ｂ５０Ｌ，江阴滨江医疗仪器厂）。

１．２方法

１．２．１百草枯降解菌的驯化与筛选称取土样１０ ｇ，无菌操作加入到１００ ｍＬ百草枯浓度为１ ｍＬ／Ｌ的液体富集培养基中，（３７±１）℃、１４０ ｒ／ｍｉｎ培养７ ｄ；取培养液以１％的接种量接入含有７ ｍＬ／Ｌ的百草枯的液体富集培养基中，（３７±１）℃、１４０ ｒ／ｍｉｎ培养

７ ｄ；如此再重复７次，即各取前一次的培养液以１％的接种量依次接入百草枯浓度分别为１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６ ｍＬ／Ｌ的液体富集培养基中，（３７±１）℃、１４０ ｒ／ｍｉｎ培养７ ｄ；取最后一次的培养液０．１ ｍＬ在基础培养基上用涂布平板和划线分离法分离、纯化百草枯降解菌，得到单菌落４ ℃保藏备用。

１．２．２百草枯降解菌株降解能力的测定

１）降解能力的初测（通过降解菌株在以百草枯为碳、氮源的培养基中的ＯＤ６００来测定试验菌株对百草枯的利用能力）。取１．２．１筛选得到的菌株活化后的菌液，按１％的接种量接入以５６ ｍＬ／Ｌ的百草枯代替原来的碳、氮源的富集培养基中，（３７±１）℃、１４０ ｒ／ｍｉｎ条件下，从培养０ ｈ到４０ ｈ每隔８ ｈ取样一次，测定培养液的ＯＤ６００，从中筛选出可以有效利用百草枯作为碳、氮源的菌株。

２）降解能力的复测。由于部分自养菌在以百草枯为碳、氮源的培养基中也可以生长，将初测筛选得到的降解菌株活化后，以１％的接种量接入以５６ ｍＬ／Ｌ的百草枯代替原来的碳、氮源的富集培养基中，同时以不加百草枯的无碳、氮源培养基为对照，（３７±１）℃、１４０ ｒ／ｍｉｎ条件下，培养至菌体利用百草枯生长后，测定培养液的ＯＤ６００，进而确定出真正可以降解利用百草枯的菌株。

２结果与分析

２．１百草枯降解菌的驯化与筛选结果

根据１．２．１的方法，经过百草枯浓度依次递增的９次的筛选试验，共从受百草枯污染的土壤中筛选、分纯出６株可在高浓度（５６ ｍＬ／Ｌ）百草枯环境中生长的菌株，分别编号为Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６，转管于４℃保藏备用。

２．２百草枯降解菌株降解能力的测定结果

2．２．１降解能力的初测结果筛选得到的６株菌活化后对百草枯降解能力的测定结果见图１。由图１可知，在第１天，除菌株Ｃ５外，其余５株菌的ＯＤ６００都呈明显的上升趋势；在第2天，６株菌的ＯＤ６００都呈下降趋势，这可能是由于第１天开始培养时，试验菌株利用接种时种子菌液中的培养基而进行生长，当种子菌液中的培養基耗尽后，菌体ＯＤ６００开始下降；从第２天到第３天，除菌株Ｃ２和Ｃ５外，其余４株菌的ＯＤ６００都呈明显的上升趋势；第３天到第４天，菌株Ｃ６的ＯＤ６００继续上升，其余各菌株都呈下降趋势，这一过程可能是由于菌体利用了培养基中的百草枯作为碳、氮源进行的二次生长，尤其以菌株Ｃ１、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ６最为明显，因此可以初步确定这４株菌对百草枯存在一定的分解利用能力。

2．２．２降解能力的复测结果由于自养菌在以百草枯为碳、氮源的培养基中也可以生长，将初筛得到的４株菌活化后，以１％的接种量接入以５６ ｍＬ／Ｌ的百草枯代替原来的碳、氮源的富集培养基中为试验组，同时以不加百草枯的无碳、氮源富集培养基为对照组，（３７±１）℃、１４０ ｒ／ｍｉｎ条件下培养３ ｄ，测定培养液的ＯＤ６００，结果见图２。由图２可知，４株试验菌株在以百草枯作为碳、氮源的培养基上均可以生长，且生长情况都优于在对照组中的生长情况，培养３ ｄ时，菌体的生物量和对照相比，均有明显增加，其中菌株Ｃ４的ＯＤ６００最高，达０．２５。由此可知，４株试验菌株均不是自养菌，它们生长过程中生物量的增加以培养基中的百草枯作为营养物质，将百草枯分解利用而生长。

３小结

试验从长期喷施百草枯而污染的土壤中筛选得到４株可以利用百草枯的菌株，以生物量为指标，４株试验菌株均可在以百草枯为碳、氮源的培养基中生长，且生长情况明显优于在对照组中的生长。培养３ ｄ时，菌株Ｃ４的ＯＤ６００最高，可达０．２５。

试验得到的４株百草枯降解菌将为微生物技术解决农残污染问题提供科学依据，具体的降解条件、培养条件的选择优化以及降解机理还有待于进一步研究。

参考文献：

［１］ 邓晓，李勤奋，陈照，等． 百草枯污染土壤的微生物生态效应［Ｊ］．中国农学通报，２００６，２２（８）：５１１－５１４．

［２］ 邓晓，唐群锋．白草枯对土壤微生物影响的研究［Ｊ］．中国生态农业学报，２００６，１４（４）：１４６－１４９．

［３］ 李艳，张有林，王宏．农药残留降解方法研究［Ｊ］． 食品研究与开发，２００４，２５（６）：３１－３３．

［４］ 郑永良，陈舒丽，刘德丽．降解农药微生物的类别及降解特性［Ｊ］．黄冈师范学院学报，２００５，２５（３）：３４－３９．

［５］ 铁存柔，黄仪秀．微生物学实验教学［Ｍ］．北京：北京大学出版社，２００５．